固氮酶铁钼辅基理化特性的研究

在紫外可见光谱区内,固氮酶铁钼辅基〔（Ｍｏ_２Ｆｅ_（１２）Ｓ_（１２））４－〕均无特征吸收峰,不含高柠檬酸盐。含双钼的铁硫簇〔（Ｍｏ_２Ｆｅ_（６～１２）Ｓ_（６～１２））~（１～４）－〕的电荷数、颜色与该金属簇中的亚铁量成对应关系,并都有较高的生物重组活性．     

植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化pH范围的理性改造及高效转化生产g-氨基丁酸

γ-氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)催化谷氨酸一步合成,反应体系成分简单、环境友好。然而,绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小,需要加入无机盐维持最适催化环境,增加了生产附加成分。此外,随着产物γ-氨基丁酸的生成,溶液pH会逐渐上升,不利于GAD酶的持续转化。本研究首先从实验室保藏的一株高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD,基于酶蛋白表面电荷修饰,选择9个位点进行定点突变及组合突变,酶学性质表征结果显示三突变体LpGAD^{S24R/D88R/Y309K}在催化pH区间内酶活力整体提高,尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活,为野生酶的1.68倍。接下来,通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理。此外,将Lpgad与Lpgad^{S24R/D88R/Y309K}突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) E01中过表达,通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40 ℃,菌体量OD₆₀₀=20,底物L-谷氨酸100.0 g/L,5-磷酸吡哆醛添加量为100 μmol/L。5 L发酵罐中,不调节pH,通过分批投料底物L-谷氨酸,γ-氨基丁酸产量高达402.8 g/L,较对照菌株提高了1.63倍。本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活,提高了γ氨基丁酸的转化效率,为实现其规模化工业生产奠定了基础。     

光谱技术研究固氮酶铁硫簇的理化特性

Ｎ－甲基甲酰胺碱度是提取高质量固氮酶铁钼辅基的关键因素之一。过量的亚甲蓝能氧化并分解铁铜铺基为含双相铁硫簇和铁硫簇固氮酶铁钼辅基和在紫外可见光谱区中均无特征吸收峰,而在３２０ｎｍ处却呈弱吸收峰,棕色固氮菌固氮酶和该菌的突变菌侏ＵＷ４５固氮酶（缺铁钼辅基）中的非含钼的铁硫簇在紫外可见光谱区３２０ｎｍ和４０５ｎｍ处均含有特征吸收峰．     

酶、多肽电荷数的理论计算及误差研究

对酶的电荷数随ｐＨ变化的定量关系进行了理论推导,将推导出的酶的电荷数与ｐＨ的关系式应用于多肽等电点的计算,理论计算结果与文献实验结果完全一致,并推导出酸性氨基酸、碱性氨基酸及中性氨基酸等电点的计算式,与现有计算式完全一致．应用荧光光谱和荧光偏振对肌酸激酶带电性随ｐＨ值的变化关系的研究表明,理论计算符合实验结果,表明：此文理论关系式是可靠的．     

北京鸭红细胞铜锌超氧化物歧化酶电荷异构体的分离和某些性质

等电聚焦表明,北京鸭红细胞铜锌超氧化物歧化酶由等电点分别为５．０,５．３,５．９,６．１和６．５的五个主要的活性组分（电荷异构体）构成,利用分析型聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳进行电荷异构体的制备级分离,采用三氯乙酸沉淀法快速确定蛋白条带的位置,电渗洗脱法回收蛋白,获得其中两个电荷异构体,对比研究结果表明电荷异构体的活性,氨基酸组成,二级结构等性质无明显差异。     

栀子提取物ZG对单纯疱疹病毒1型细胞吸附的影响

采用负染技术,借助高倍电子显微镜观察栀子提取物ZG作用后,病毒颗粒及其病毒吸附蛋白(virus attach-ment protein,VAP)的变化,考察药物是否直接改变或破坏病毒包膜蛋白的结构,使其失去感染性;采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记病毒,以肝素钠为参照,借助冷却慢扫描电荷耦合器件荧光成象技术,用Aquacomos软件进行图象分析,以探讨栀子提取物ZG不同加药方式对HSV-1吸附量的影响。结果表明栀子提取物ZG对HSV-1包膜表面的VAP无直接破坏作用,不影响病毒对Hep-2细胞的感染性;先加入肝素钠再进行病毒吸附及肝素钠病毒同时加入培养细胞这两种用药方式可明显减少细胞表面病毒的吸附量;栀子提取物ZG各种不同加药方式均能阻止HSV-1对Hep-2细胞表面的吸附,使病毒吸附量减少。     

华北平原冬小麦农田蒸散量

以华北平原冬小麦农田为研究对象,采用涡度相关技术和热红外遥感技术,研究了不同环境条件下土壤含水量与农田蒸散量及作物冠层温度的关系.结果表明,冬小麦在农田郁闭(LAI≥3)、晴天和土壤相对含水量低于田间持水量65%的情况下,蒸发比值日变化正午前后出现相对较低且平稳的变化趋势.在晴天情况下,农田潜热通量与作物冠层温度日变化和季节变化均呈极显著的非线性相关关系,而冠气温差、农田相对蒸散量则与0～100 cm土层的土壤相对含水量密切相关.以13:30～14:00的平均冠层温度值T_c、日最高气温T_{a max}和日净辐射总量Rn_d为统计数据,确立了冬小麦农田日蒸散量ET_d （mm）估算简化模式参数.     

科研快讯

PNAS:科学家开发出新型的流感可吸入疫苗近日,一篇发表于国际杂志Proceedings of the National Academy of Sciences上的研究论文中,来自北卡罗来纳州立大学的研究人员利用纳米颗粒开发出了一种制造可吸入疫苗的新技术,该研究或可用于靶向治疗肺部特异性疾病,比如流感、肺炎和肺结核。文章中,研究者Cathy Fromen表示,这种颗粒的表面电荷在刺激肺部免疫反应上扮演着重要角色,利用非润湿模板粒子复制技术(PRINT),我们就可以对装载蛋白的颗粒表面的电荷进行特异性修饰,同时也可以避免其它颗粒特性的破坏,这就表明,PRINT技术具有独立修饰纳米颗粒     

高效液相色谱法测定重组人纽兰格林的电荷变异体

目的:重组蛋白在表达和纯化过程中,甚至在存放过程中,都有可能产生降解、聚集,错误折叠、翻译后修饰(如:糖基化、氧化、脱酰胺),从而形成不同的表面电荷,影响产品的稳定性、活性和安全性。该研究旨在确定重组人纽兰格林原液中是否存在电荷变异体并对其定量。方法:采用极端的理化变性条件,制备重组人纽兰格林的电荷变异体;用HPLC(阳离子交换色谱柱,Tosoh Bioscience LLC,TOSOH TSK gelSP-STAT(4.6mm×10cm),7μm)分析重组人纽兰格林中的电荷变异体。结果:纯度99%以上的重组人纽兰格林原液,经酸破坏、高温条件下,产生了相对保留时间为1.1,质谱分子量为5786.28,N末端序列未发生变化的电荷变异体。重组人纽兰格林浓度在0.0156 mg/mL~1.25 mg/mL范围内,浓度与峰面积呈现良好的线性关系,y=17187x-309.09 R2=0.9998。专属性好:在流动相A、流动相B、水、重组人纽兰格林缓冲液中无重组人纽兰格林及电荷变异体峰。回收率:重组人纽兰格林在低(0.5mg/mL)、中(1.0mg/mL)、高(1.25mg/mL)3个浓度的回收率分别为99.0%、99.9%、100.7%。重复性:以重组人纽兰格林峰面积计算RSD为0.57%。最低检测限:电荷变异体的最低检测限为:0.16μg。最低定量限:电荷变异体的最低定量限为0.2μg。结论:该方法用于测定重组人纽兰格林电荷变异体,无杂质干扰,方法准确、可靠。     

紫膜表面电荷数的测量

以CAT₁₂为自旋探针,用ESR自旋标记法测量了不同表面pH时酰化前后紫膜表面负电荷密度,以酰化所屏蔽的表面电荷数为标准,计算了表面pH4-11时单位菌紫质紫膜两侧的总负电荷数.结果表明:表面pH5-9时为9,表面pH≥10及表面pH < 5时增大.结果有力支持了膜表面5个二价阳离子结合位点的模型.