固氮酶铁钼辅基理化特性的研究

在紫外可见光谱区内,固氮酶铁钼辅基〔（Ｍｏ_２Ｆｅ_（１２）Ｓ_（１２））４－〕均无特征吸收峰,不含高柠檬酸盐。含双钼的铁硫簇〔（Ｍｏ_２Ｆｅ_（６～１２）Ｓ_（６～１２））~（１～４）－〕的电荷数、颜色与该金属簇中的亚铁量成对应关系,并都有较高的生物重组活性．     

植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化pH范围的理性改造及高效转化生产g-氨基丁酸

γ-氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)催化谷氨酸一步合成,反应体系成分简单、环境友好。然而,绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小,需要加入无机盐维持最适催化环境,增加了生产附加成分。此外,随着产物γ-氨基丁酸的生成,溶液pH会逐渐上升,不利于GAD酶的持续转化。本研究首先从实验室保藏的一株高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD,基于酶蛋白表面电荷修饰,选择9个位点进行定点突变及组合突变,酶学性质表征结果显示三突变体LpGAD^{S24R/D88R/Y309K}在催化pH区间内酶活力整体提高,尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活,为野生酶的1.68倍。接下来,通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理。此外,将Lpgad与Lpgad^{S24R/D88R/Y309K}突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) E01中过表达,通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40 ℃,菌体量OD₆₀₀=20,底物L-谷氨酸100.0 g/L,5-磷酸吡哆醛添加量为100 μmol/L。5 L发酵罐中,不调节pH,通过分批投料底物L-谷氨酸,γ-氨基丁酸产量高达402.8 g/L,较对照菌株提高了1.63倍。本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活,提高了γ氨基丁酸的转化效率,为实现其规模化工业生产奠定了基础。     

光谱技术研究固氮酶铁硫簇的理化特性

Ｎ－甲基甲酰胺碱度是提取高质量固氮酶铁钼辅基的关键因素之一。过量的亚甲蓝能氧化并分解铁铜铺基为含双相铁硫簇和铁硫簇固氮酶铁钼辅基和在紫外可见光谱区中均无特征吸收峰,而在３２０ｎｍ处却呈弱吸收峰,棕色固氮菌固氮酶和该菌的突变菌侏ＵＷ４５固氮酶（缺铁钼辅基）中的非含钼的铁硫簇在紫外可见光谱区３２０ｎｍ和４０５ｎｍ处均含有特征吸收峰．     

不同光学异构体组成的氯氰菊酯对敏感及抗性家蝇的神经电生理学研究

采用敏感家蝇(Musca domestica vicina L.)及由5种不同光学异构体组成的氯氰菊酯选育的抗性家蝇中胸足离体标本,观测五种药剂对足感觉神经纤维冲动发放的影响。各种异构体组成的氯氰菊酯均可引起感觉神经纤维发放的增加,然后逐渐降低,直至完全阻断。以阻断时间和加药剂量为参数,求出神经敏感度。结果表明：五种药剂作用于敏感家蝇的神经敏感度与室内生物测定的LD₅₀值(μg/头)无相关性,而与供试药剂中反α体与顺α体的比例有关,反α体所占比例越多的药物,神经敏感度越高。抗性家蝇的神经敏感度与敏感 家蝇相比大幅度下降,可以认为神经敏感度降低是家蝇对氯氰菊酯产生抗性的主要机制。抗性家蝇中,氯氰菊酯品系(RC₁)的抗生水平最高,但它的神经敏感度较其它抗性品系也高,由此推测,RC₁,的抗性机制与其它晶系有所不同。     

苦丁茶中绿原酸及其异构体的提取变化分析

以富含绿原酸类成分的苦丁茶(Ilex kaushue)为材料,使用溶剂甲醇、乙醇、丙酮和水,结合超声波提取、水浴提取、回流提取等方法对绿原酸及其异构体的提取效率及提取后各异构体的变化进行分析。应用超高效液相色谱法可使苦丁茶的6种绿原酸类成分及咖啡酸在6 min内实现分离。提取结果表明,丙酮作为提取溶剂,在采用超声波和水浴提取时能获得较高的提取效率,易获得较多总量的绿原酸类成分和高含量异绿原酸A。而最常用的溶剂乙醇并未达到理想的提取效果。在不同溶剂的回流提取中,虽然提取的绿原酸类成分总量接近,但异绿原酸A和异绿原酸C含量有较大差异。醇溶液特别是乙醇溶液的回流提取使异绿原酸C的量大幅增加,而相应的异绿原酸A的量大幅减少,表明在醇加热条件下,异绿原酸A转化为异绿原酸C,这为获得抗氧化性更强的异绿原酸C提供了新思路。     

酶、多肽电荷数的理论计算及误差研究

对酶的电荷数随ｐＨ变化的定量关系进行了理论推导,将推导出的酶的电荷数与ｐＨ的关系式应用于多肽等电点的计算,理论计算结果与文献实验结果完全一致,并推导出酸性氨基酸、碱性氨基酸及中性氨基酸等电点的计算式,与现有计算式完全一致．应用荧光光谱和荧光偏振对肌酸激酶带电性随ｐＨ值的变化关系的研究表明,理论计算符合实验结果,表明：此文理论关系式是可靠的．     

FoxM1与癌发生的相关剪接机制的探讨

FoxM1是一种原癌基因。它也是癌发生、发展密切相关的重要的转录因子。Fox M1是Forkhead Box转录因子家族重要成员,定位于染色体12p13.3,特异性表达于增殖期细胞中,在细胞终末分化时消失,是一个典型的与细胞增殖相关的转录因子,在细胞G/S及G/M期转换过程中发挥重要作用。它具有Fox M1A、B和C三种剪接异构体。Fox M1B和C在癌组织中高表达,发挥转录激活、促癌发生和发展的作用,而Fox M1A在癌组织中低表达,发挥转录抑制功能。癌组织中Fox M1B/C的优先选择对于Fox M1发挥促癌作用非常关键。因此对这一现象的成因即Fox M1癌相关选择性剪接机制的研究非常重要。     

人TRAF3IP3基因剪接异构体2的克隆表达和生物信息学分析

[目的]克隆、原核表达并纯化人类TRAF3IP3基因剪接异构体2(TRAF3IP3iso2),对TRAF3IP3iso2蛋白进行生物信息学分析。[方法]从人骨髓单个核细胞c DNA中扩增TRAF3IP3iso2开放阅读框区,双酶切连入原核表达载体p ET-28a(+),重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达效果,Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白;根据测序结果对TRAF3IP3iso2蛋白进行生物信息学分析。[结果]成功克隆了人类TRAF3IP3iso2编码区并构建了原核表达载体p ET-28a(+)-TRAF3IP3iso2,在大肠杆菌中诱导表达、纯化获得了相对分子量约22.7k Da的融合蛋白;生物信息学分析显示TRAF3IP3iso2蛋白二级结构以α螺旋为主,无TRAF3IP3iso1蛋白的跨膜区结构。[结论]证明了人类TRAF3IP3iso2的存在,为TRAF3IP3功能的研究提供了实验依据。     

共轭亚油酸对脂肪代谢相关基因表达的影响

本文利用实时定量PCR的测定方法,分析了两种共轭亚油酸(CLA)异构体对3T3-L1小鼠前脂肪细胞脂肪代谢相关基因表达的影响。本研究CLA异构体的处理浓度和时间为75.4μmol/L,8 d,测定了与能量代谢、细胞凋亡、脂肪酸氧化作用和脂解作用相关的多种基因的mRNA水平。结果显示:两种异构体均能够显著提高UCP1、UCP3、Perilipin和PPARα的mRNA水平,而抑制UCP2的表达水平(P<0.01)。与cis-9t,rans-11CLA相比t,rans-10c,is-12 CLA显著提高PKA(P<0.05)、CPT-1和TNF-α(P<0.01)的mRNA水平。与对照组相比,两种CLA异构体处理组均对HSL、ATGL、ACO和Leptin的基因表达无显著影响。