植物类异戊二烯生物合成途径的调节

主要介绍植物中通过甲羟戊酸形成类异成二烯的生物合成途径,参与酶和基因调节的研究进展,并指出通过基因工程技术生产这些重要化合物的前景。     

蛹虫草磷酸甲羟戊酸激酶和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因的功能分析

【目的】确定蛹虫草甲羟戊酸途径中的2个关键酶——磷酸甲羟戊酸激酶(CmErg8)和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(CmErg19)的功能及其对麦角甾醇和虫草素含量的影响。【方法】通过生物信息学分析鉴定蛹虫草中CmErg8和CmErg19,并采用酵母互补确定其功能是否保守;以蛹虫草尿嘧啶营养缺陷型CmΔpyrG为背景菌株,利用农杆菌介导的转化方法对CmErg8和CmErg19进行过表达,观察其对麦角甾醇和虫草素含量的影响。【结果】CmErg8和CmErg19不能互补酵母erg8和erg19突变体的温度敏感表型;CmErg8和CmErg19过表达菌株中麦角甾醇和虫草素含量均有所增加,特别是CmErg19基因过表达可以使虫草素含量提升5倍左右。【结论】本研究揭示了蛹虫草CmErg8和CmErg19的功能,并且发现蛹虫草麦角甾醇合成通路基因可能会影响虫草素含量。     

甲羟戊酸通路对细胞生长调控作用的研究进展

甲羟戊酸(MVA)通路对细胞生长具有重要的调节作用,MVA及其衍生物通过对蛋白质异戊烯化和N糖基化修饰而影响Ras蛋白、生长因子及受体的功能、细胞内信号转导和细胞的生长。MVA通路参与血管活性物质生成的调节是其调节细胞生长的另一机制。MVA生成的限速酶羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMGCoA)则受MVA通路衍生物的反馈抑制。HMGCoA还原酶抑制剂通过抑制MVA及其衍生物的生成而抑制细胞的生长和增殖。     

Heterologous Expression of the Mevalonic Acid Pathway in Cyanobacteria Enhances Endogenous Carbon Partitioning to Isoprene

Heterologous expression of the isoprene synthase gene in the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 conferred upon these microorganisms the property of photosynthetic isoprene （C5H8） hYdrocarbons production. Continuous production of isoprene from CO2 and H2O was achieved in the light, occurring via the endogenous methylerythritolphosphate （MEP） pathway, in tandem with the growth of Synechocystis. This work addressed the issue of photosynthetic carbon partitioning between isoprene and biomass in Synechocystis. Evidence is presented to show heterologous genomic integration and cellular expression of the mevalonic acid （MVA） pathway genes in Synechocystis endowing a non-native pathway for carbon flux amplification to isopentenyl-diphosphate （IPP） and dimethylallyl-diphosphate （DMAPP） precursors of isoprene. Heterologous expression of the isoprene synthase in combination with the MVA pathway enzymes resulted in photosynthetic isoprene yield improvement by approximately 2.5-fold, compared with that measured in cyanobacteria transformed with the isoprene synthase gene only. These results suggest that the MVA pathway introduces a bypass in the flux of endogenous cellular substrate in Synechocystis to IPP and DMAPP, overcoming flux limitations of the native MEP pathway. The work employed a novel chromosomal integration and expression of synthetic gene operons in Synechocystis, comprising up to four genes under the control of a single promoter, and expressing three operons simultaneously. This is the first time an entire biosynthetic pathway with seven recombinant enzymes has been heterologously expressed in a photosynthetic microorganism. It constitutes contribution to the genetic engineering toolkit of photosynthetic microorganisms and a paradigm in the pursuit of photosynthetic approaches for the renewable generation of high-impact products.     

植物萜类化合物的生物合成及应用

萜类化合物是植物中广泛存在的一类代谢产物,在植物生长、发育过程中起重要作用。植物中的萜类化合物有2条合成途径,即甲羟戊酸途径和甲基赤藓糖醇磷酸途径。这2条途径中都存在一系列调控萜类化合物生成、结构和功能各异的酶。植物萜类化合物不仅在植物生命活动中起重要作用,而且具有重要的商业价值,被广泛用于工业、医药卫生等领域。     

磷甘霉素和洛伐它汀处理对中国红豆杉悬浮培养细胞生物合成紫杉醇的影响

采用非甲羟戊酸途径抑制剂磷甘霉素和甲羟戊酸途径抑制剂洛伐它汀对中国红豆杉悬浮细胞培养物进行处理.在添加和未添加茉莉酸甲酯诱导的情况下,前者使紫杉醇产量减少了2/5和1/5,后者使紫杉醇产量减少了1/6和1/10,表明两种途径对紫杉醇的生物合成都具有贡献,其中非甲羟戊酸途径贡献较大;通过定量PCR技术分别检测两条途径的关键酶5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)mRNA水平的变化,发现两种抑制剂都能够激活hmgr和dxr的转录,表明两种代谢途径之间存在协同作用,共同为紫杉醇的生物合成提供前体.     

解脂耶氏酵母中羽扇豆醇合成途径的构建与调控

羽扇豆醇因其具有抗癌抗炎等生理活性而广泛应用于医药领域.本研究分别利用源自木榄和蓖麻的羽扇豆醇合酶(LUS)在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中构建生物合成羽扇豆醇途径(GLU-1、GLU-2),并由对该途径中关键限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶(tHMGR)和异戊烯基二磷酸异构酶(ID...     

酿酒酵母合成异源单萜类化合物的研究进展

单萜类化合物在食品、医药和工业等领域有重要的应用,具有可观的经济价值.随着合成生物学的日益发展,利用微生物作为细胞工厂合成单萜类化合物成为时下的研究热点.酿酒酵母是真核生物表达的模式菌株,其甲羟戊酸途径为单萜类化合物的合成提供直接前体,因此在酿酒酵母中构建异源单萜类化合物合成途径有较大优势.本文介绍了酿酒酵母细胞中异源单萜类化合物合成途径的构建.从甲羟戊酸途径代谢通量调控机制和融合酶调控酶催化反应效率两方面概述了酿酒酵母异源合成单萜类化合物的研究进展.     

甲羟戊酸途径限速步骤研究及其在产番茄红素重组大肠杆菌中的应用

甲羟戊酸途径(MVA途径)被引入重组大肠杆菌中,能够提高重组大肠杆菌中萜类化合物的合成能力。但因重组大肠杆菌中萜类化合物合成途径中间产物积累,导致细胞生长和萜类化合物合成受到限制。本研究在稳定表达MVA途径以及优化2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径(MEP途径)、番茄红素合成途径关键基因表达的重组大肠杆菌LYC103中,用质粒高表达MVA途径和番茄红素合成途径关键基因,挖掘该途径的限速步骤。结果表明,ispA、crtE、mvaK1、idi和mvaD基因过表达后,细胞生长没有明显变化,番茄红素产量依次提高了13.5%、16.5%、17.95%、33.7%和61.1%,说明这几个基因可能是合成番茄红素的限速步骤。mvaK1、mvaK2、mvaD三个基因在同一操纵子上,用mRNA稳定区(RNA stabilizing region)进行启动子文库(mRSL)调控mvaK1,相当于对3个基因同时调控。用高效基因组编辑技术(CAGO)对mvaK1基因的mRNA稳定区进行启动子文库的调控,得到菌株LYC104。番茄红素产量与对照菌株LYC103相比增加了2倍,细胞生长提高了32%。然后,利用CRISPR-Cas9技术在染色体lacZ位点整合idi基因,得到LYC105菌株。与出发菌株LYC103相比,细胞生长提高了147%,番茄红素产量增加了2.28倍。本研究在染色体上具有完整MVA途径的基础上,利用质粒高表达单个基因挖掘限速步骤,用同源重组方法整合限速基因、解除限速,为代谢工程构建高产菌株提供新策略。     

滇龙胆甲羟戊酸激酶基因的克隆与表达分析

甲羟戊酸激酶是甲羟戊酸途径的关键酶。根据滇龙胆转录组甲羟戊酸激酶基因Gr MK序列,设计一对基因特异性引物克隆该基因,并进行序列分析;构建原核表达载体p GEX-4T-1-Gr MK,转入大肠杆菌Rosetta(DE3),重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导下成功表达。生物信息学分析结果表明,Gr MK蛋白为甲羟戊酸激酶家族成员,具有MK蛋白保守结构域:乳糖激酶/高丝氨酸激酶/甲羟戊酸激酶/磷酸甲羟戊酸激酶(GHMP kinase)N端结构域、C端结构域和ATP结合结构域;Gr MK与长春花Cr MK亲缘关系最近.原核表达结果表明,融合蛋白相对分子质量与推断大小一致。组织特异性表达分析结果表明Gr MK基因主要在根中表达.这些结果为Gr MK蛋白结构和功能的研究奠定基础。