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成功构建pET-24a-tscd质粒,实现Thermococcus sp.Strain B1001来源的环糊精酶(TsCDase)在Es-cherichia coli BL21(DE3)中表达.通过热处理和镍柱分离对重组TsCDase进行纯化.酶学性质研究表明,重组TsCDase的比活为1 208.04 U/mg,最适温度为90℃、最适pH值为5.5.重组酶TsCDase在85℃、90℃、95℃条件下的半衰期分别为180、120、30min.酶转化研究表明,以80 g/L β-环糊精为底物,当酶转化温度为90℃、反应pH值为5.5~6.0,加酶量为25 U/g,反应时间为4 h时,麦芽七糖产率为81.19%和85.95%,七糖占产物麦芽寡糖的比例为95.24%和92.92%.本研究结果为工业化制备麦芽七糖奠定良好基础. 相似文献
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环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextringlycosyltransferase,CGTase)酶法合成环糊精是目前生产环糊精的主要方法。本文介绍了用于生产环糊精葡萄糖基转移酶的几种工程菌株:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及毕赤酵母,其中大肠杆菌是目前应用最广泛的用于表达CGTase的表达系统。除此之外,本文还总结了高效表达环糊精葡萄糖基转移酶的有效策略:选择合适的表达载体、启动子以及信号肽,以及密码子优化和分子伴侣共表达,以期为在相关CGTase研究领域开展研究提供参考。 相似文献
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探讨α-环糊精糖基转移酶(CGT酶)活性区域-3亚位点(47位赖氨酸残基),-7亚位点(146~152位氨基酸残基)以及环化中心位点(195位酪氨酸残基)对其催化底物形成γ-环糊精(CD)能力的影响。将α-CGT酶相应位点分别进行如下突变:K47T,Y195I,以及146~152位氨基酸残基替换为异亮氨酸(命名为△6),并在大肠杆菌BL21中实现异源活性表达。以可溶性淀粉作为底物进行转化,利用HPLC分析各种突变酶的催化产物中3种环糊精产量和比例。结果表明,和野生酶相比,所有突变酶的淀粉水解活性和环糊精总生成量都有不同程度的下降。在产物的组成方面,突变酶Y195I的催化产物中,α-CD的含量由68%降为30%,β-CD由22.2%提高为33.3%;而γ-CD由8.9%提高为36.7%,含量提高了4倍,取代α-CD成为产物中的主要成分;γ-CD的实际产量为1.1 g/L,是野生酶(0.4 g/L)的3倍。突变酶K47T和△6的转化产物中α-CD比例有不同程度下降,但仍然是产物中的主要组分,β-和γ-CD的比例都有所增加。由此可见,活性区域中195位氨基酸对于α-CGT酶的活力和催化选择性具有重要的影响,Y195I突变体酶最有利于选择性形成γ-CD。纯化后突变酶Y195I的酶学性质试验表明,其最适反应温度和野生酶相同,但最适反应pH有所提高,且比野生酶具有更好的pH稳定性。因此,突变酶Y195I具有生产制备γ-CD的潜力。 相似文献
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本文旨在通过对毛细管电泳在手性药物拆分方面的应用原理的探讨,对实验中关于手性选择剂的浓度、缓冲液pH值等对分离拆分效果的影响进行讨论和分析,以期对药物研究有所裨益并得到令人满意的结果。 相似文献
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目的:制备奈妥吡坦/β-环糊精包合物,用以提高奈妥吡坦的水溶性.方法:采用饱和水溶液法,制备奈妥吡坦/β-环糊精包合物;以载药量为指标,考察奈妥吡坦与β-环糊精的质量比(芯壁比)、包合温度、包合时间、搅拌速度的影响.基于单因素试验结果,采用正交设计实验对制备处方和工艺进行优化,得到最优奈妥吡坦/β-环糊精包合物,并对其... 相似文献
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复合与合成培养基对大肠杆菌胞外生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的影响 总被引:2,自引:0,他引:2
为实现来源于Paenibacillus macerans JFB05-01的α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT酶)的高效胞外表达,以含分泌型信号肽OmpA的大肠杆菌E.coli BL21(DE3){pET-20b(+)/α-cgt}为研究对象,比较了其在不同诱导条件下复合与合成培养基中生长产酶的规律。结果表明在添加甘氨酸的条件下采用合成培养基,以0.8 g/L/h的乳糖进行流加诱导所得的胞外酶活和生产强度最高。在该条件下发酵30小时后胞外α-CGT酶的环化活性达113.0U/ml(水解活性为79 100.0IU/ml),是复合培养基胞外产酶的2.3倍,完全满足工业化生产的需求。 相似文献
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利用高效阴离子色谱快速直接地检测微生物发酵液中的环糊精成分,尤其是大环环糊精的组成,进而创造了一种能快速准确地从土壤中筛选产环糊精糖基转移酶菌种的方法。共分离了149个产胞外淀粉水解酶的微生物菌株,利用高效阴离子交换色谱共检测了其中11株菌,其中6株主要产CD6 ,5株主要产CD7,主要产CD8的没有。在直接鉴定产生环糊精糖基转移酶菌株的过程中,也可以定量检测各种环糊精包括大环糊精(CD大于8)的含量。 相似文献
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环糊精及其衍生物在多肽/蛋白质类药物非注射给药体系中的应用 总被引:1,自引:0,他引:1
目前,多肽/蛋白质类药物多数需要采用注射剂型给药以确保其生物利用度。开发易于给药、病人顺应性高以及治疗费用更低的非注射剂型是非常有意义的。然而,多肽/蛋白质类药物直接进行非注射给药的生物利用度通常非常低,需要制备具有设计功能的载药系统,例如加入不同比例的酶抑制剂、吸收促进剂等以提高生物利用度。环糊精及其衍生物由于其能与客体分子形成包合物的特性,以及对粘膜的促渗透作用等,在多肽/蛋白质药物的非注射给药系统中获得了日益广泛的应用。综述了近年来环糊精及其衍生物在多肽/蛋白质类药物非注射给药体系中的应用情况。 相似文献