RT－cDNA克隆－PCR法获取犬瘟热病毒融合蛋白基因（F）

纯化鸡胚成纤维细胞培养的犬瘟热病毒（ＣａｎｉｎｅＤｉｓｔｅｍｐｅｒＶｉｒｕｓ,ＣＤＶ）,获得病毒基因组ＲＮＡ后,反转录合成双链病毒Ｆ基因ｃＤＮＡ。将此双链ｃＤＮＡ平端插入ＰＵＣ１９质粒ＳａｍⅠ位点构建重组质粒,进行ｃＤＮＡ克隆。以重组克隆质粒为模板ＰＣＲ扩增,获得ＣＤＶ全长Ｆ基因。将此Ｆ基因插入表达载体ＰＢＶ２２０,在大肠杆菌中表达,通过对表达产物的最终鉴定,可确认所获片段为ＣＤＶ全长Ｆ基因．     

犬瘟热与野生动物

犬瘟热是一种犬瘟热病毒引起的多种动物共患传染病,在世界范围内的家犬和野生动物中多次爆发。犬瘟热的跨种间传播对多种野生动物如东北虎、非洲狮、雪豹、大熊猫等野生动物的种群安全造成严重威胁,并且感染的宿主范围仍在扩大。近年来的研究表明,犬瘟热病毒的不断变异和野生动物栖息地内流浪犬只的增多使我国野生动物尤其是野外种群正在面临犬瘟热的严重威胁。为了更好地应对犬瘟热对野生动物的危害,本文综述了犬瘟热的病原特征和在野生动物中的流行病学、致病机制、诊断与治疗以及疫苗免疫方面的研究进展,在此基础上提出了针对传染源、传播途径、易感动物三方面的控制措施来减少野生动物犬瘟热的传播风险。目前,由于国内自然保护区科研技术力量欠缺以及防控意识薄弱,对于野生动物犬瘟热的监测处于空白状态,这无疑加大了野生动物犬瘟热的防控难度。因此,为了保障我国野生动物种群安全,我们需要加强在野生动物犬瘟热监测与流行病学方面的研究工作,建立有效的监测防控体系将犬瘟热阻挡在野生动物种群之外。     

犬瘟热病毒临床流行野毒株F蛋白信号肽区分析

根据GenBank上发表的犬瘟热病毒(CDV)融合蛋白基因(F)序列, 设计引物扩增F蛋白部分信号肽区, 片段长369 bp。对2005年~2007年收集的犬瘟热阳性的水貂、狐、貉实质脏器、血液、尿液等样品进行扩增, 获得了13个CDV F蛋白部分信号肽区基因片段。序列分析发现, CDV野毒F蛋白该区段核苷酸与氨基酸序列与目前我国使用疫苗株CDV3及其他国内外疫苗株比较存在较大差异, 与CDV3对应区段的核苷酸同源性在80.7%~83.2%之间, 而推导的对应氨基酸序列同源性只有64.8%~71.3%。部分信号肽区的氨基酸疏水性分析, 推测其调控功能也发生变化, 本研究为CDV遗传变异和分子流行病学提供理论数据。     

犬瘟热病毒体外感染人源细胞的分子研究进展北大核心CSCD

犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)是一种主要通过呼吸道传播对犬科动物造成严重危害的烈性传染病。近年随着CDV在灵长类动物中暴发,研究者开始关注CDV是否具有潜在感染人的风险。目前虽然无直接证据证明CDV可在人体内定殖,但CDV在体外能感染人源细胞,且人体内CDV关键受体SLAM和Nectin-4与灵长类动物具有极高的同源性,因此我们必须高度重视CDV对人类的潜在威胁。本文对CDV分子结构特征、CDV感染宿主靶细胞过程、CDV入侵宿主所需关键受体以及CDV野毒株体外感染人源细胞等方面进行综述,分析CDV对人是否具有潜在感染的风险。     

犬瘟热病毒抗原表位T’TB和犬细小病毒VP2蛋白的共表达及免疫小鼠特异性抗体的测定

应用PCR方法扩增犬细小病毒VP2基因,将其克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的转移载体pFastBacHTc上,命名为pFastBacHTc-VP2,将人工合成的犬瘟热病毒抗原表位基因T'TB克隆至VP2基因的上游,命名为 pFastBacHTc-T'TB-VP2.进而转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得携带犬瘟热病毒T'TB细胞表位和犬细小病毒VP2基因的重组转染质粒Bacmid-BacHT-T'TB-VP2,将其转染昆虫细胞Sf-9后获得融合重组T'TB-VP2蛋白,大小约为70 ku.经Western blot分析,结果显示:表达的蛋白具有良好的免疫原性.表达的重组蛋白在无佐剂参与的情况下,按确定的免疫程序免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,检测小鼠的体液免疫学指标.结果表明:表达蛋白能诱导小鼠产生抗CDV和CPV的特异性中和抗体.本实验为重组犬瘟热与犬细小病毒新型亚单位疫苗的研制奠定了重要的物质基础.     

狐、貉和水貂犬瘟热病毒受体SLAM 的基因克隆及其真核表达

信号淋巴激活分子(SLAM)为犬瘟热病毒(CDV) 感染其宿主动物识别的细胞受体。本试验应用RT -PCR 从狐狸、貉和水貂的外周血淋巴细胞中克隆到其相应SLAM 基因。基因测序比较发现,狐狸、貉与同科的犬SLAM 基因编码区长度均为1 029 bp,核苷酸同源性高于98.6% ;而水貂SLAM 基因编码区长度为1 020 bp,与以上三种动物遗传关系较远(核苷酸同源性< 83.7%),但与海豹SLAM 基因遗传关系较近(核苷酸同源性为91.4% )。基于不同动物SLAM 基因序列的系统进化树分析显示,犬、狐狸、貉、水貂和海豹在进化树上构成了以CDV 为感染宿主的遗传分支。氨基酸序列比较显示,该5 种动物SLAM 分子上均存在一个长度为26 个氨基酸的信号肽序列,且在空间结构上影响宿主--病毒特异性的8 个关键氨基酸均完全保守。通过构建表达该狐狸、貉、水貂SLAM 基因的三种真核表达质粒,分别转染CRFK 细胞后,应用CDV 强毒感染试验证实,CDV 均能在三种转染细胞上产生明显的细胞病变效应(CPE),而未转染CRFK 细胞对照无CPE 产生,由此证实作为CDV细胞受体的狐、貉和水貂的SLAM,体外表达后能明显增强犬瘟热强毒株对非敏感细胞的感染能力。     

犬瘟热病毒XJ株的分离鉴定

应用犬肺原代巨噬细胞,从新疆阿克苏送检的一只病死犬肺脏中分离出1株犬瘟热病毒,并对其进行了形态学、理化学、血清学、动物感染试验、分子生物学鉴定。结果证明所分离的XJ株为1株CDV的强毒株。     

犬瘟热病毒临床流行野毒株F蛋白信号肽区分析

根据GenBank上发表的犬瘟热病毒(CDV)融合蛋白基因(F)序列,设计引物扩增F蛋白部分信号肽区,片段长369 bp.对2005年～2007年收集的犬瘟热阳性的水貂、狐、貉实质脏器、血液、尿液等样品进行扩增,获得了13个CDVF蛋白部分信号肽区基因片段.序列分析发现,CDV 野毒F蛋白该区段核苷酸与氨基酸序列与目前我国使用疫苗株CDV3及其他国内外疫苗株比较存在较大差异,与CDV3对应区段的核苷酸同源性在80.7%～83.2%之间,而推导的对应氨基酸序列同源性只有64.8%～71.3%.部分信号肽区的氨基酸疏水性分析,推测其调控功能也发生变化,本研究为CDV遗传变异和分子流行病学提供理论数据.     

熊猫等动物犬瘟热病毒附着蛋白基因的遗传多样性

为了研究犬瘟热病毒（ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ,ＣＤＶ）大熊猫株、小熊猫株和长春犬株附着蛋白（Ｈ）基因的遗传这异,对Ｈ基因进行了序列测定。上述３个ＣＤＶ毒株的Ｈ基因全长均为１９４６ｂｐ,开放阅读框架（ＯＲＦ）始于２１－２３位的ＡＴＧ,终止于１８４２－１８４４位的ＴＧＡ,编码６０７个氨基酸。与ＧｅｎＢａｎｋ中１５个ＣＤＶ株推导的Ｈ蛋白氨基酸序列比较发现,１６个野毒株潜在的Ｈ－联糖基     

大熊猫犬瘟热病毒融合蛋白基因3‘端的序列测定

从死亡大熊猫的肝脏中直接提取细胞总ＲＮＡ,经反转录后,用犬瘟热病毒的两对引物,分两段扩增出融合蛋白基因３＇端的片段。经序列分析表明：此片段的长度为６９３ｂｐ;此毒株在核苷酸和氨基酸水平与某疫苗弱毒株、Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株、海豹瘟热病毒２型毒株和海豹瘟热病毒１型的同源性分别为９７．５％和９６．２％、８８．６％和９４．５％、９２．９％和９５．６％、６３．２％和７６．５％;大熊猫毒株与其它毒