论以居民健康为中心的医疗卫生服务提供体系建设

目前我国医疗卫生服务体系已无法完全满足居民与日俱增的健康需要与需求,急需构建以居民健康为中心的整合型医疗卫生服务提供体系,包括分级诊疗模式与社区契约服务。针对医疗卫生服务体系在发展过程中所受制约,建议进一步调整完善我国的医疗卫生服务提供体系,加强机构建设与人才培养,尤其是慢病急救医疗服务体系与慢病专项人才梯队的构建;在继续推动整合型医疗卫生服务提供体系的发展中,要加强医保、医疗服务供方和需方三方联动,保证以居民健康为中心的整合型医疗卫生服务体系的构建没有短板、有效运行。     

一个硫链丝菌素抗性基因标记、用于DNA导入链霉菌的pSET152衍生载体

[目的]在链霉菌PCR-targeting系统中,安普霉素是使用最普遍的选择标记.然而在基因敲除阶段利用安普霉素选择标记后,在遗传补偿时就不能使用相同选择标记的许多重要载体,如pSET152.这常给研究带来不便,特别是当研究对象基因如一些调控基因,其生理功能对剂量敏感时更是如此.基于此,拟以pSET152为基础构建一个不以安普霉素为抗性标记的通用整合型载体.[方法]利用融合PCR和λRed重组等方法构建载体.[结果]来自pHZ1358上的硫链丝菌素抗性基因tsr和来自pCR2.1的氨苄抗性基因bla以“tsr在前bla在后”的次序融合.融合后的抗性片段替换pSET 152上的安普霉素抗性基因aac(3)-Ⅳ,从而获得新载体pGIM6626.利用该载体将删除的榴菌素最小聚酮合酶基因重新导入到Streptomyces vietnamensis突变株中,该突变株恢复了产榴菌素的能力,证实了该载体的有效性.[结论]构建了一个新的pSET152衍生载体pGIM6626.该载体包含氨苄和硫链丝菌素抗性基因,分别在大肠杆菌和链霉菌中作为选择标记.pGIM6626与pSET152用途相似,但前者由于与PCR-targeting系统不存在选择标记的冲突而与该系统更兼容.     

透明颤菌血红蛋白基因在刺糖多孢菌中整合表达促进多杀菌素的生物合成

为解决刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)高密度深层培养过程中的供氧不足问题, 促进多杀菌素的生物合成, 采用重叠PCR 技术将透明颤菌(Vitreoscillastercoraria)血红蛋白基因(vgb)可读框(ORF)置于红霉素抗性基因启动子(P_ermE)之下, 并将其克隆到整合型载体pSET152 上, 构建成vgb 表达载体pSET152EVHB; 通过接合转移方式将其导入刺糖多孢菌SP06081 中, 利用载体上ΦC31 整合性位点通过位点特异性重组将vgb 定点整合到SP06081 菌株染色体上, 获得一株遗传性能稳定的重组菌株S078-1101; 重组工程菌的PCR 与Southern blotting 检测显示vgb 已整合到染色体上, 一氧化碳结合差光谱分析表明在S078-1101 工程菌中表达了有活性的透明颤菌血红蛋白(VHb); 摇瓶发酵结果显示, 在正常溶氧与中度限氧状态下, vgb 的表达均可显著促进多杀菌素的生物合成(P<0.01). 这说明vgb 在刺糖多孢菌中的整合表达改善了菌体对溶氧的吸收性能, 是一种有效的定向遗传改良手段.     

产β-胡萝卜素酿酒酵母工程菌的构建

以酿酒酵母SaccharomycescereviaiaeBY4742为宿主菌,利用DNA组装（DNAassemble）技术,向宿主菌导入了β-胡萝卜素合成途径,表达了源自Xanthophyllomycesdendrorhous的CrtE,Cn馏和CrtI3个基因,获得了一株染色体整合型工程菌株HCCB08531,β-胡萝卜素产量达3．68mg／g干重。     

甲醇酵母表达系统

甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母 ,主要有Ｈ .Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、ＣａｎｄｉｄａＢｏｄｉｎｉｉ、ＰｉｃｈｉａＰａｓ ｔｏｒｉｓ三种 ,其中ＰｉｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉｓ作为基因表达系统使用得最多、最广泛[1] 。与以往的基因表达系统相比 ,它具有无可匹敌的高表达特性 ,已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。1 .外源蛋白质的基因在甲醇酵母中的高效表达目前已有多种蛋白质的基因在该表达系统中克隆成功 ,包括蛋白酶、酶抑制剂、受体、单链抗体等 (…     

酵母整合型载体的构建及其功能分析

选取酿酒酵母基因组rDNA序列中25S和5S rDNA之间的一段约2.2 kb序列作为整合载体同源重组到酿酒酵母基因组中的靶位点,PCR扩增得到该段序列左右2段大小分别为865 bp和1 350 bp的片段,将其与 URA3、磷酸丙糖异构酶启动子和终止子序列依次克隆入pUC18中,构建成整合型载体pNK.以绿色荧光蛋白基因为报告基因,荧光显微镜下观察到酿酒酵母菌株INVSc1转化子发出较强荧光,Southern 杂交产生目的条带,这些结果表明载体 pNK 具有整合并表达外源基因功能.通过对转化子连续培养证明构建的整合型载体的稳定性较高.