一种经miniSOG标记的人腺病毒的制备

为了探索腺病毒感染细胞后病毒核心在胞内运输的过程,本研究构建了一株经miniSOG标记IX蛋白的人腺病毒。首先,我们通过重叠延伸PCR的方法合成了miniSOG基因,将其克隆至pcDNA3表达载体后转染293细胞,荧光显微镜下可观察到miniSOG蛋白的表达,经固定,封闭,DAB-H2O2染色,OsO4固定染色后,可见表达miniSOG蛋白的细胞呈深褐色。之后将miniSOG构建至腺病毒穿梭载体pShuttle的IX基因3’端,并通过与骨架质粒pAdeasy-1在E.coli BJ5183细菌内同源重组获得了重组腺病毒质粒pAd5-IXSOG。pAd5-IXSOG质粒经PacI酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组腺病毒HAdV-5-IXSOG。经过8轮扩增,超速离心纯化后获得2.0ml浓度为6.0×1011vp/mL的重组腺病毒,电子显微镜下可见完整病毒颗粒。本研究经反向遗传学技术对腺病毒载体进行改造,成功制备了经miniSOG标记的重组腺病毒HAdV-5-IXSOG,该病毒可用于腺病毒感染细胞的实时追踪。     

H3N2亚型猪流感病毒的拯救及HA与NA基因的替换

摘要：【目的】为研究流感病毒突破种间屏障分子机制,筛选流感基因工程疫苗株。【方法】本实验以猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)为亲本株,利用反向遗传学操作技术,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接, 重组质粒转染293T和MDCK共培养细胞,拯救出全部基因均来自于亲本株的猪流感病毒rgH3N2,并分别以人流感病毒A/ PR/8/34(H1N1)、禽流感病毒A/Duck/Nanchang /4-165/2000 (H4N6 )、马流感病毒A/Equine/Fuyun/2008/(H3N8)的HA和NA基因替换A/Swine/Henan/S4/01的相应基因,【结果】生物学实验结果表明rgH3N2在鸡胚半数感染量、组织培养半数感染量、稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。rgH3N2经鸡胚多次传代后血凝价最高可达到1:256,接种MDCK细胞60 h后,血凝价可以达到1:64。基因替换后成功拯救出的重组病毒rgH1N1、rgH4N6和rgH3N8在鸡胚和细胞上均具有较高的增殖能力。【结论】病毒的成功拯救为流感病毒突破种间屏障分子机制,HA、NA基因在流感病毒跨种属传播中所扮演角色的研究和流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。     

野黄瓜(Cucumis hystrix Chakr.)与3种不同基因型栽培黄瓜(C.sativus L)

野黄瓜(Cucum is hystrix,2n=24)为短日照植物,因其与栽培黄瓜(C.sativus,2n=14)花期不遇等杂交障碍的存在而使种间杂交难以顺利进行。对野黄瓜短光照处理40 d以上,使得两者花期相遇,成功地进行了野黄瓜与3种不同基因型栽培黄瓜(“二早子”、“长春密刺”和“NC4406”)的正反杂交,从中获得了3种杂交组合的幼胚。采用改良的方法对这3种基因型杂种胚进行胚胎拯救,再生频率达80%以上,其杂种的真实性通过植物学性状观察、体细胞染色体计数和天冬氨酸转氨酶(AAT)同工酶分析得到了证实。研究中还发现不同基因型杂种F1的育性存在明显差异,其中以C.hystrixדNC4406”育性最高,花粉可染率达23.3%,是在二倍体水平上进行育种利用的良好材料。     

兰属种间杂交胚拯救研究初报

取兰属大花蕙兰为母本、墨兰为父本进行种间杂交并进行杂种胚拯救研究。结果显示,子房离体培养明显优于胚珠离体培养,是胚抢救培养的有效手段。不同取材时间及在不同培养基中子房培养情况差异明显。在授粉后60 d子房离体培养即可获得成功,但以授粉后90 d子房离体培养最佳,萌发率高,达80%。子房培养的最适培养基为VW+BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蛋白胨3 g/L+水解酪蛋白500 mg/L+椰子汁10%。     

通过和玉米杂交诱导硬粒小麦单倍体

硬粒小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ Ｄｅｓｆ．）ＤＲ１４７授以超甜玉米（Ｚｅａ ｍ ａｙｓ Ｌ．） ｓｓ ７７００的花粉后,在８３．４％ 的柱头上观察到花粉萌发及花粉管长入胚囊,有９．９％ 的子房发生了卵细胞的单受精,１．９％ 的子房发生了中央细胞的单受精,３２．７％ 的子房发生了双受精。尽管双受精后可同时形成胚和胚乳,但胚乳往往发育迟缓,甚至败育。硬粒小麦×玉米形成的杂合子核型高度不稳定,在最初的几次细胞分裂中,来自父本玉米的染色体逐步被排除,最后形成硬粒小麦单倍体胚。在授以玉米花粉４ ｈ 后用１００ ｐｐｍ ２,４－Ｄ溶液浸蘸硬粒小麦穗部,可以有效地促进幼胚在缺乏胚乳或胚乳败育情况下的生长和发育。授粉９—１３ ｄ 后由５３３个硬粒小麦子房解剖出２５个胚,得胚率为４．７％ 。通过幼胚拯救获得１１棵正常植株,植株获得率为２．１％ 。根尖细胞染色体计数表明,它们为单倍体（２ｎ＝ ２ｘ＝ １４）。     

梅与山桃远缘杂交亲和性初步研究

为培育早花抗寒梅花新品种,以梅(Prunus mume)品种‘江梅’(P.mume‘Jiangmei’)、‘淡丰后’(P.mume‘Dan Fenghou’)与山桃(P.davidiana)、‘白花’山桃(P.davidiana‘Alba’)为亲本进行杂交试验,记录种间杂交结实率,观察花粉管生长,对未成熟胚进行培养。结果表明:(1)梅与山桃、‘白花’山桃杂交结实率很低,‘江梅’ב白花’山桃未结果,结实率最高的组合为‘淡丰后’×山桃,也仅有7.4%,且杂交果实的果核内部分胚干瘪、败育。(2)山桃和‘白花’山桃的花粉在梅柱头上都能正常萌发,但花粉管生长受抑制,多数花粉管到达花柱中部即弯曲、缠绕、断裂,花粉管生长过程中有大量的胼胝质产生,表现较低的杂交亲和性,但不同种间杂交亲和程度又有所不同。(3)通过未成熟胚培养获得了杂种苗。研究表明,梅与同属种杂交存在不亲和性,幼胚拯救是获得梅与李属其他种远缘杂交杂种苗的有效途径。     

利用Gibson DNA组装技术构建人5型腺病毒感染性克隆

为了构建人5型腺病毒(HAdV-5)的感染性克隆,我们使用了Gibson DNA组装技术。设计1对引物用于扩增质粒骨架(包含卡那霉素抗性基因和质粒的复制起点,KAN-ORI),在引物的5'端添加HAdV-5基因组末端序列(约30NT)和Pac I位点,以携带卡那霉素抗性基因的pShuttle-CMV质粒为模板,PCR扩增得到KAN-ORI片段,该片段的两端均含有约30bp的HAdV-5基因组序列。将KAN-ORI片段与利用野毒扩增纯化的HAdV-5基因组混合,进行Gibson DNA组装反应;反应产物直接转化E.coli感受态细胞,涂布含卡那霉素的LB琼脂平板。挑取菌落,提取质粒,命名为pKAd5。限制性酶切鉴定的结果显示,所鉴定的质粒均含有完整的HAdV-5基因组。使用PacⅠ酶切线性化pKAd5,利用脂质体转染293细胞,转染4d后单层细胞出现病毒噬斑。拯救的病毒能够在HEp-2细胞扩增;电子显微镜观察呈现典型的腺病毒形态;提取病毒DNA,酶切鉴定的结果与预期的HAdV-5基因组相同,证实HAdV-5得到成功拯救。上述研究结果说明使用Gibson DNA组装技术构建HAdV-5感染性克隆简便易行,为其他DNA病毒基因组的克隆提供了新思路。     

H5N1亚型禽流感病毒NS第263—277位核苷酸缺失提高病毒对鸡的致病力

为研究2000年以来绝大多数H5N1亚型禽流感病毒分离株在非结构基因的第263—277位发生15个碱基缺失现象的生物学意义,构建H5N1A／D／SD／04株HA、NA、NS的全基因表达／转录载体,以及NS的删除突变载体（m248）,A/D/YZ/04株的NS基因表达／转录载体（848）和其补加15个核苷酸的NS突变载体（m848）。构建的载体分别与编码WSN（H1N1）内部基因载体进行组合转染,拯救获得4个具不同NS的重组的H5N1亚型流感病毒：RWSN-848和RWSN—m248在263-277位缺失15个碱基。RWSN-m848和RWSN-248则在相同位置不发生缺失。4个重组病毒的平均鸡胚繁殖效价（HA）、鸡胚的平均死亡时间（MDT）和鸡胚半数感染量（EID50）均无显著差异;但RWSN-848和RWSN-m248对6周龄SPF鸡的致病力明显高于RWSN—m848和RWSN-248。结果说明H5N1的NS基因在263～277位核苷酸发生缺失后,不影响重组H5N1在鸡胚中的繁殖性能,但提高了病毒对鸡的致病力。     

猪圆环病毒2型双拷贝感染性DNA的构建及体外拯救

感染性分子克隆是研究病毒复制和致病机制的有力工具。本研究应用PCR诱变技术解决了外源片段易于自连的难题,成功将2个PCV2SD1株全基因组(DQ346683)头尾相接插入到真核生物表达载体pSK的多克隆位点中,构建重组质粒pSK-2PCV2;另外课题组成功构建含单个PCV2全基因组的pSK-PCV2和自身环化质粒ds-PCV2。将所得3种质粒分别转染无PCV污染的PK-15细胞系,经10次连续传代后,间接免疫荧光试验检测显示三者均在细胞核中聚集大量的病毒抗原;经RT-PCR检测都有PCV2特异性基因转录;透射电镜下可观察到直径约为17～20nm的典型PCV2病毒粒子;经测序鉴定所拯救出的病毒与亲本病毒核苷酸同源性为100%。拯救出的PCV2与亲本病毒具有相同的病毒学及分子生物学特性。本研究应用PCR诱变技术成功构建PCV2双拷贝感染性克隆,并经体外拯救证实其具有感染性,为进行PCV2分子特性及致病机理研究打下了基础。     

冷适应减毒B型流感病毒疫苗候选株的制备及鉴定

以冷适应、温度敏感、减毒的B/Ann Arbor/1/66流感病毒株作为重配病毒骨架,对其6个内部基因片段进行了全基因合成,同时人工引入9个氨基酸突变．构建了8个基因的拯救载体,经测序获得序列准确的拯救质粒,命名为：pAB121-PB1, pAB122-PB2, pAB123-PA, pAB124-HA, pAB125-NP, pAB126-NA, pAB127-M和pAB128-NS．在成功拯救冷适应A型流感病毒的基础上,利用反向遗传学技术成功获救了具有感染性的重配B型流感病毒株,命名为rMDV-B．该重配病毒株以B/Ann Arbor/1/66为病毒骨架,其中HA和NA来源于2006～2007年当年流行株B/Malaysia/2506/2004．rMDV-B在鸡胚尿囊液和MDCK细胞中的HA效价可达1∶64～1∶512．实验结果暗示：从单一供体病毒株可以产生有效的减毒活B型流感病毒疫苗候选株,能够为将来人用流感疫苗的设计提供可借鉴的模型．