蜚蠊灭菌肽的诱导及初步分离分析

昆虫经诱导盾产生灭菌肽的研究近年来已有很大进展,有关这方面的研究工作绝大多数都是以有翅亚纲内生翅类鳞翅目(主要是蚕类)昆虫和少数双翅目昆虫为材料.本文首次以有翅亚纲外生翅类蜚蠊目的美洲蜚蠊(Ptriplaneta americana L.)为实验昆虫,用Escherichia coil K₁₂ strain D₃₁作诱导源,对不同发育期、不同性别、不同成虫期的蜚蠊进行诱导后,采用含菌培养基平板测活方法,就存在个体数及能产生抗菌物质的个体数进行了初步的研究.发现成虫日龄在10天之内的雄性蜚蠊能够产生抗菌物质的个体百分比最高.抗菌物质出现的高峰期是在诱导后第三、四天.用滴滴涕和溴氰菊酯作诱导源对雄性蜚蠊的诱导实验表明,杀虫剂也能诱导蜚蠊产生抗菌物质,而且所诱导产生抗菌物质的活性强度(用抑菌圈直径表示)高于大肠杆菌所诱导的.滴滴涕和溴氰菊酯的重复诱导可提高蜚蠊产生抗菌物质个体百分比.蜚蠊经诱导后产生的抗菌物质具有广谱性,对苏云金杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌及绿脓杆菌等有较强的抗菌活性,而对大肠杆菌D₃₁、大肠杆菌、粘质沙雷氏杆菌和溶壁微球菌等有较弱的抗菌活性.用肽类物质的指纹图谱法分离蜚蠊血淋巴抗菌物质,发现经诱导后血淋巴中确有新的肽类物质产生,该物质具抗菌活性,用DABITC法分析,其N-末端氨基酸为赖氨酸.     

柞蚕抗菌肽D中精氨酸、赖氨酸和色氨酸等氨基酸残基的化学修饰

用不同的化学试剂修饰了柞蚕抗菌肽D分子中的色氨酸、精氨酸和赖氨酸等氨基酸残基。NBS修饰抗菌肽D,以及氨肽酶M对抗菌肽D作用的结果表明色氨酸残基对抗菌肽D抑制E.coli D31的作用影响不大。CHD和MLH对精氨酸和赖氨酸残基的修饰,导致抗菌肽D失去抑制E.coli的作用,但可逆地消除CHD和MLH的修饰作用后,抗菌肽D恢复了对E.coli D31的抑菌作用。这些结果初步认为,抗菌肽D抑菌作用与分子中的荷电性有关,改变了分子的电荷,也就同时失去了其抑菌功能。 此外,对精氨酸残基修饰的结果还表明,抗菌肽D的免疫原性与精氨酸残基有关。但是,抗菌肽D的免疫决定簇与其生物活性中心并不完全平行。     

利用饵料微藻表达抗菌肽及其初步应用

为了解抗菌肽在饵料微藻中表达后的抗菌特性,构建海洋微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)、湖泊微拟球藻(N.limnetica)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的抗菌肽(源自虹鳟,Cath-1a)表达质粒,分别转化相应的微藻,检测转化子中抗菌肽的表达量和体外抑菌效果,将藻株作为鱼饲料添加剂喂食斑马鱼,初步分析了抗菌肽及藻体自身的岩藻黄素和多不饱和脂肪酸对鱼免疫系统的影响。结果表明,外源抗菌肽在3种微藻中均可以成功表达,体外抑菌试验表明,仅三角褐指藻对水产领域常见致病菌爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)有一定的抑菌效果,然而抗菌肽的表达并未使3种藻株的体外抑菌性增加。添加藻粉对斑马鱼的生长无明显影响,通过检测鱼体肝脏中与抗氧化和免疫相关基因的表达水平及丙二醛的含量,表明添加藻粉可增强斑马鱼的抗氧化和抗炎症能力,表达抗菌肽(PtC组)能进一步提高斑马鱼的免疫力。另外,添加Pt6(富含岩藻黄素)藻粉组比添加PtC的抗炎效果更显著,表明三角褐指藻中的岩藻黄素和二十碳五烯酸对增强鱼的抗病能力具有潜在作用。     

基于果蝇口腔感染的肠道训练免疫模型研究（英文）

目的 利用果蝇作为遗传工具从个体和分子层面研究果蝇的训练免疫效应,并为后续深入研究其分子机制提供依据。方法 首先构建无菌果蝇模型,在此基础上构建果蝇成虫及跨发育阶段训练免疫模型,用两种革兰氏阴性菌——胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora carotovora 15）及铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）分别经口腔感染果蝇。在第一次感染完全消退后进行再次感染,然后通过比较果蝇在两个感染阶段的存活率和细菌量来衡量训练免疫的潜在效果。通过实时荧光定量PCR检测相应先天免疫相关基因的表达水平,研究革兰氏阴性菌对免疫缺陷（IMD）通路的诱导作用。结果 果蝇成虫及幼虫初次感染均可提高二次感染后的生存率、细菌清除效率及死亡时能承受的最高细菌负荷;二次感染的果蝇中,IMD通路中免疫反应基因的基础表达比未感染的高,这提供了获得感染抗性的分子基础;果蝇的免疫反应主要发生在中肠,二次免疫比初次免疫的效应更迅速且剧烈;二次免疫的果蝇中,肠道干细胞的数量显著多于初次感染。结论 果蝇肠道中强大的训练免疫可由同源或异源革兰氏阴性菌口腔感染引发,且免疫记忆可在整个发育阶段持...     

昆虫抗菌肽的研究进展

昆虫的种类繁多,约几百万种,为适应各种不同的生态环境,建立了自己独特的免疫系统,抗菌肽就是免疫体系中的关键成分,过去,抗菌肽的主要研究方面是昆虫免疫和昆虫生化,目前不少工作从分子水平上进行探讨。     

家蝇Phormicin A多克隆抗体的制备及效价检测

家蝇Phormicin作为防御素家族的成员,是一类具有广普抗菌活性的抗菌肽.本研究采用原核表达法表达并纯化获得了家蝇PhormicinA蛋白.将家蝇Phormicin A原核表达蛋白与完全佐剂和不完全佐剂乳化混匀,先后免疫新西兰白兔获得其多克隆抗体.通过原核表达蛋白中和吸附实验,以及Western blot实验验证了抗体的特异性.进一步用金黄色葡萄球菌刺激家蝇三龄幼虫样品,进行内源性验证并测定抗体的效价.结果 显示,该多克隆抗体既可以识别家蝇Phormicin A原核表达蛋白,也可以识别金黄色葡萄球菌刺激家蝇三龄幼虫产生的内源性Phormicin A蛋白.本研究为进一步探索Phormicin在家蝇天然免疫和防御中的机制等后续工作打下基础.     

昆虫抗菌肽对肿瘤细胞的抑制作用研究进展

昆虫抗菌肽(antimicrobial peptide,AMPs)是一类昆虫先天免疫系统中十分重要的效应因子,它分子量小、热稳定,并且具有广谱抗菌性,能够抑制、杀死多种细菌、真菌.近几年来,由于昆虫抗菌肽具有抗肿瘤的活性且其不具有抗原性而受到研究者的广泛关注.昆虫种类多、分布广,因此昆虫抗菌肽具有很高的开发潜力和实际应用价值.但是,目前对于昆虫抗菌肽抗肿瘤能力的研究尚不够深入,对其作用机制还没有一套准确并且系统的理论.现在普遍认为昆虫抗菌肽的抗肿瘤机制与其抗菌机制类似,可以分为破坏细胞膜机制以及非破坏细胞膜机制,并且同一种昆虫抗菌肽可以通过多种方式来抑制甚至杀死肿瘤细胞,但是对正常真核细胞无明显的毒副作用.相较于传统化疗药物的无差别杀伤,昆虫抗菌肽在肿瘤治疗领域有着巨大潜力.本文简要综述了昆虫抗菌肽对肿瘤细胞的抑制作用及其作用机制,并对其开发潜力和实际应用价值进行了展望,以期为今后的研究提供理论支持.     

西伯利亚蝗抗菌肽基因的克隆及表达特性研究

[目的]扩增西伯利亚蝗Gomphocerus sibiricus抗菌肽(attacin)基因,并对其进行生物信息学分析,同时分析西伯利亚蝗不同组织中抗菌肽基因的差异表达.[方法]基于RACE技术从西伯利亚蝗中克隆得到抗菌肽,利用生物信息学软件对西伯利亚蝗抗菌肽的一级结构、二级结构、三级结构、系统进化和亚细胞定位进行分析.采用实时荧光定量PCR技术检测了西伯利亚蝗抗菌肽基因在马氏管、中肠、后肠、脂肪体和唾液腺中的相对表达量.[结果]克隆获得的抗菌肽基因的开放阅读框为282 bp,编码93个氨基酸,其编码蛋白预测理论分子量为9.98 ku,等电点为9.26.抗菌肽氨基酸序列中存在信号肽序列.基因定量分析显示,抗菌肽基因在西伯利亚蝗的中肠中表达量最高.[结论]attacin在西伯利亚蝗成虫不同组织中差异表达,提示其消化道在防御病原微生物的入侵中起着重要的作用.     

黄粉虫抗菌肽在大肠杆菌中表达条件优化及活性分析

为了提高黄粉虫抗菌肽基因tmAMP1m在大肠杆菌中的表达量,研究了培养温度、诱导时间及IPTG浓度等不同条件对HIS-TmAMP1m融合蛋白表达量和活性的影响。通过Tricine-SDS-PAGE分析确定最佳表达条件,同时,通过琼脂孔穴扩散法检测其抑菌活性。结果表明,含有重组质粒的大肠杆菌在37℃,使用终浓度为0.1 mmol/L IPTG培养4 h时,融合蛋白表达量较高,可占细菌总蛋白40%以上,抗菌活性最好。用Ni2+亲和层析纯化获得较纯的融合蛋白,Western blotting分析表明其能与His单克隆抗体起特异性反应。诱导表达的融合蛋白对宿主菌生长产生一定程度抑制。融合蛋白经100℃煮沸10 h,在20℃反复冻融10次,与强酸强碱缓冲液、不同的有机溶剂和蛋白酶混合后都具有极强的稳定性,仍然表现出良好的抗菌活性。此外,最小抑菌浓度(MIC)测定结果表明,融合蛋白对5种菌具有良好的抗菌活性。研究结果为昆虫抗菌肽推广应用和进一步研究奠定了基础。     

青蛤抗菌肽基因的克隆及其在组织间的表达分析

利用构建的SMART-cDNA文库及高通量测序方法,获得了青蛤抗菌肽macin家族相关基因(mytimacin)的全长序列,采用荧光定量PCR方法分析了mytimacin在青蛤各组织的表达情况,并在鳗弧菌胁迫下分析了mytima-cin在外套膜中的时序表达关系。结果表明,mytimacin基因全长461bp,开放阅读框为261bp,编码86个氨基酸,具有24个氨基酸的信号肽序列;荧光定量PCR结果显示,该基因在血液、肝脏、外套膜、鳃和闭壳肌等组织中普遍表达,其中外套膜表达水平最高,在鳃中表达最低;在鳗弧菌刺激后6～24h,青蛤外套膜中mytimacin的表达量出现明显上调的趋势且与对照组差异显著(P<0.05),说明mytimacin抗菌肽基因在青蛤的免疫反应中具有重要作用。