血清岩藻糖测定方法学研究

本文对血清岩藻糖测定方法进行了系统研究。血清用量由200μL减至50μL,显色反应4h内稳定。吸收峰在396nm。岩藻糖浓度40μg/mL内线性良好,批间CV=2.1％。以Sephadex-G200层析,血清岩藻糖主要存在于分子量为500kD的组分中。以本法测得30例健康人血清岩藻糖浓度为588.1±172.0μmol/L。     

重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法的验证

目的 对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法亲水相互作用液相色谱法进行方法学验证,并根据多批次产品的检测结果制定质量标准。方法 参考《中华人民共和国药典》2020版(三部)通则9101中相关要求及重组人源化抗CD52单克隆抗体的制造与检定规程,对单克隆抗体N-糖糖型的分析方法进行方法学验证,验证项目包括专属性、线性、准确度、精密度、范围和耐用性。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体产品(≥15批)的N-糖糖型的检测结果进行分析,计算非岩藻糖及半乳糖的相对含量,确定质量标准。结果 空白对照、阴性对照对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析无干扰;在60～300μg的抗体含量范围内线性良好,r²≥0.99;高、中、低3种抗体含量的回收率均在96%～106%;仪器进样重复性、样品制备重复性及中间精密度均良好,峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%;耐用性考察时各条件下的峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体的检定结果进行统计分析,确定N-糖糖型分析的质量标准为非岩藻糖相对含量4%～20%,半乳糖相对含量≥2...     

敲除Pofut1不影响胚胎干细胞向神经元分化

蛋白O-连接岩藻糖基转移酶1 (Pofut1)基因缺失可导致Notch分子无法与配体结合并启动信号传递. 为研究Pofut1基因对哺乳动物胚胎干细胞（ESC）向神经分化的影响,利用Pofut1基因敲除的胚胎干细胞与野生型胚胎干细胞,经体外培养诱导拟胚体（EB）分化为神经细胞,计数分化为神经细胞的比例,采用细胞免疫组化染色和real-time PCR等方法,分析神经细胞特异性标志分子的表达. 结果显示,Pofut1基因缺失后,对EBC生长没有明显影响,分化过程中形成的拟胚体数量明显增多,分化的神经样细胞以及神经标志物分子的表达也明显多于对照组;Notch信号缺失对小鼠胚胎干细胞生长无明显影响,但可以促进ES细胞向神经细胞分化.     

肺癌组织中岩藻糖化糖链结构免疫组化研究

Lewis X(Le~x)、唾液酸化的Lewis X(Sialyl Lewis X,SLe~x)和唾液酸化的双岩藻糖Lewis X(Sialyl Dimeric Lewis X,SDLe~x)是细胞表面外侧带α1,3岩藻糖的糖链结构。本文用免疫组化ABC法研究了肺癌原发灶、转移灶和癌旁组织中这三种抗原结构的表达。结果发现这三种抗原在肺癌细胞表面及胞浆中均有不同程度的表达,而在肺癌癌旁组织及正常肺组织中未见表达。有转移的肺癌和(或)低分化肺癌中这三种抗原结构的表达要明显高于未发生转移和高、中分化肺癌中相同抗原结构的表达。其中以SLe~x的表达与肺癌细胞的转移能力和分化程度关系最为密切。另外,肺癌浸润转移的淋巴结中也有Le~x、SLe~x的明显表达和SDLe~x的少量表达,而未被肺癌浸润转移的淋巴结中就没有它们的表达。     

肌醇、唾液酸及岩藻糖代谢途径对嗜水气单胞菌致病性的影响

【目的】调查肌醇、唾液酸以及岩藻糖代谢途径在嗜水气单胞菌感染宿主过程中对细菌致病性的影响。【方法】采用同源重组技术分别缺失嗜水气单胞菌NJ-35株的肌醇代谢相关基因iolC、唾液酸代谢相关基因nanA和岩藻糖代谢相关基因fucK,测定各缺失株对斑马鱼的半数致死量(LD_(50));将野生株与缺失株共感染鲫鱼,统计野生株和缺失株在不同组织中的细菌载量。【结果】各代谢相关基因的缺失均成功阻断了菌株对相应底物的降解能力。iolC的缺失导致菌株对斑马鱼的LD50升高近12倍,而nanA和fucK的缺失对LD50没有明显影响。野生株与iolC缺失株共感染鲫鱼,肝脏、脾脏和肾脏中野生株的载量显著高于缺失株,表现出明显的生长优势;nanA和fucK缺失株与野生株共感染鲫鱼,野生株和缺失株载量在各组织中均无明显差异。【结论】肌醇代谢途径在嗜水气单胞菌感染致病过程中发挥重要作用,而唾液酸和岩藻糖代谢途径对细菌无明显影响。     

胸腺细胞表面岩藻糖化抗原在细胞凋亡过程中变化的初步研究

细胞表面糖在细胞分化及细胞周期中均有一定的变化,而且还与细胞间的识别与信息传递有关,为了解膜表面糖复合物在细胞凋亡过程中的作用,通过地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡的模型,利用对８种抗原结构相关的寡糖特异的单克隆抗体,观察凋亡过程中胸腺细胞表面岩菏糖化糖抗原结构的变化,免疫组化的分析结果表明,正常胸腺细胞表面的糖抗原主要是含有岩藻糖基的Ｈ－２和Ｌｅ＾ｂ,而凋亡的胸腺细胞表面出现ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａ     

细胞表面糖链末端唾液酸和岩藻糖和某些细胞生物学行为的关系

用神经氨酸酶和α-L-岩藻糖苷酶分别切除人肝癌细胞株7721细胞表面糖链中的末端唾液酸（SA）和岩藻糖（Fuc)残基来研究表面聚糖结构和某些细胞生物学行为之间的关系。选择细胞对纤连蛋白（Fn）,层黏蛋白（Ln)和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的黏附能力,细胞趋化性迁移以及趋化性侵袭作为细胞行为的指标。结果表明：表面人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的黏附能力,细胞趋化性迁移以及趋化性侵袭作为细胞行为的指标。结果表明：表面糖链末端SA对细胞黏附至Fn并不必需,对细胞黏附至Ln和细胞的趋化性侵袭却至为重要,而对细胞黏附至HUVEC以及趋化性迁移则为关键性残基。与SA相比,Fuc可能参与细胞Fn,Ln和HUVEC的黏附,但对趋化性迁移以及趋化性侵袭并不重要。细胞对HUVEC的黏附以及趋化性迁移和侵袭可被唾液酸化Lewis X(SLe^x)单抗抑制,但不被未唾液酸化的Lewis X(Le^x)单抗抑制,这一结果支持SA在上述三种细胞过程中Fuc残基重要。     

人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白质的鉴定及生物信息学分析

糖蛋白质组学方法鉴定人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白质,将有助于发现肝癌、慢性肝病相关异常核心岩藻糖基化蛋白质.应用凝集素亲和层析技术、双向电泳(2-DE)联合基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)分析,建立人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白表达谱,图谱均点数为(130±3)个,挖取90个蛋白质点进行质谱鉴定,数据库搜索及去冗余后,共鉴定53种蛋白质,主要分布于pI5～9,分子质量为10～100ku区域处.Gene Ontology分类发现它们参与体内代谢等过程,应用NetNGlyc对它们进行糖基化位点预测,并通过蛋白质免疫沉淀联合凝集素亲和印迹对其中的结合珠蛋白前体,α烯醇化酶的核心岩藻糖基化进行了再验证.以上结果提示,凝集素层析、2-DE联合MALDI-TOF-MS/MS分析是一种鉴定某种特定类型糖蛋白的高通量检测方法,所建立的表达谱可用于发现疾病发生、发展中相关的异常核心岩藻糖基化蛋白质.     

用凝集素和非同位素标记底物测定核心α－1，6－岩藻糖转移酶及其应用

报道了一个不需同位素和ＨＰＬＣ的α－１,６－岩藻糖转移酶（α１,６ＦｕＴ,又称核心岩藻糖转移酶）的测定法,包括从正常人血浆提纯运铁蛋白,消化成带有天冬酰胺（Ａｓｎ）的二天线Ｎ－糖链,去除外端唾液酸和半乳糖后,用生物素酰胺乙酰基团标记其Ａｓｎ,并以此生物素衍生物标记的Ａｓｎ－七糖的Ｎ－糖链为受体底物,ＧＤＰ－Ｌ－岩藻糖为供体底物,用ＬＣＡ柱吸附法分离岩藻糖化后的产物,再用ＨＲｐ－Ａｖｉｄｉｎ交联物与柱上带有生物素的产物结合,此ＨＲＰ－Ａｖｉｄｉｎ－生物素。岩藻糖化产物从柱上洗脱后测定ＨＲＰ活力可代表α１,６ＦｕＴ活力。此法在较宽的范围内,产物量与酶量和反应时间成正比．人肝细胞癌、亚硝胺诱发大鼠肝癌后期或用佛波酯（ＰＭＡ）处理人肝癌细胞后,α１,６ＦｕＴ增高,而用视黄酸或ｄｂ－ｃＡＭＰ处理人肝癌细胞后,则该酶活力降低。