嗜热酶的耐热机理

酶蛋白在高温下的不稳定性是影响其广泛应用的主要瓶颈,嗜热酶因为独特的性质而被作为热稳定研究的极好材料。了解嗜热酶的热稳定性机制,对于采用酶工程定向设计、改造酶具有重要的意义。嗜热酶的热稳定性并不是由单一因素决定的,氨基酸组成、氢键、离子对、二硫键等都是影响嗜热酶热稳定性的重要因素。相对于嗜温酶,嗜热酶更多地采用寡聚体的形式。     

Sortase A介导的(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体高效立体选择性转化(S)-苯基乙二醇

【目的】以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的sortase A为"分子订书机",用于(S)-羰基还原酶Ⅱ分子之间的连接,获得催化功能与稳定性增强的氧化还原酶寡聚体,高效催化2-羟基苯乙酮,合成(S)-苯基乙二醇。【方法】从S.aureus基因组中克隆sortase A基因,在大肠杆菌中表达,通过镍柱和凝胶层析纯化重组酶,获得纯酶sortase A。通过基因工程手段在(S)-羰基还原酶Ⅱ的C末端添加GGGGSLPETGG序列,蛋白纯化获得(S)-羰基还原酶Ⅱ-GGGGSLPETGG,摸索了sortase A催化(S)-羰基还原酶Ⅱ-GGGGSLPETGG的分子连接,形成(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体的最佳条件,并研究了寡聚体酶学性质及生物转化(S)-苯基乙二醇的效率。【结果】(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体比酶活力为38.5 U/mg,比原始型(S)-羰基还原酶Ⅱ提高了6倍,最适反应温度为50°C,最适pH为6.0,在50°C放置1 h后酶活仍旧保持90%以上;蛋白质变性实验结果显示,(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体的变性温度为60.1°C,比原始酶提高了10°C;生物转化结果显示(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体在3 h内完全转化5 g/L 2-羟基苯乙酮,产生光学纯度为100%的(S)-苯基乙二醇,相比于重组大肠杆菌(S)-羰基还原酶Ⅱ全细胞催化时间缩短了16倍。【结论】本研究首次将sortase A应用于氧化还原酶的分子连接,显著提高了酶的催化效率和热稳定性,表明sortase在手性催化中有很大的潜在应用价值。     

β- 淀粉样多肽低分子量寡聚体对大鼠学习记忆功能的影响

目的:探究Aβ低分子量寡聚体对大鼠学习记忆功能的影响;方法:双侧海马内一次性注射Aβ低分子量寡聚体,15天后开始进行行为测试,测试方法采用跳台实验法、穿梭实验法和Morris水迷宫法;结果:跳台实验结果显示,与对照组比较,Aβ组跳台潜伏期短,错误次数多,差异有统计学意义(P<0.05);穿梭实验结果显示,与对照组比较,Aβ组由明箱进入暗箱的潜伏期短,错误次数多,差异有统计学意义(P<0.05);水迷宫实验结果显示,与对照组比较,Aβ组潜伏期长,跨越原平台次数少,差异有统计学意义(P<0.01);结论:Aβ组大鼠学习记忆能力和空间分辨能力降低,Aβ低分子量寡聚体在大鼠体内表现出较强的毒性作用。     

单体在正二十面体衣壳中的聚集形式及其参数间的关系

单体(或称胥白亚单位)在正二十面体病毒衣壳中按一定数量“等价”和“准等价”的原则聚集成各种形式的寡聚体和壳粒。本文通过三角形坐标和病毒的构型分析了单体在衣壳上的各种排列、组合。并阐述了单体数与其它衣壳参数之间的关系。同时,对各种正二十面体病毒衣壳中的单体总数进行了计算。 1.单体在正二十面体衣壳中的聚集形式 单体是构成病毒衣壳较为简单的结构单位,它以     

Aβ寡聚体调控M1胆碱受体下游信号转导通路的机制研究

摘要 目的：阿尔茨海默病（Alzheimer''s disease, AD）病理状态下M1胆碱受体功能受损,无法对配体做出正确响应。本研究模拟AD早期Aβ寡聚体富集的病理状态,考察对M1胆碱受体下游信号通路关键分子活性的影响,以期为AD病理状态下M1胆碱受体信号偶联障碍机制提供新的见解。方法：制备Aβ寡聚体（Aβ oligomers, AβOs）,1 μM AβOs预处理CHO-M1细胞30 min、24 h和48 h,加入胆碱受体激动剂乙酰胆碱或者卡巴胆碱激活M1胆碱受体,利用Ca²⁺检测实验、IP-One-Gq KIT检测实验及Western blot实验检测受体激动后下游关键信号分子Ca²⁺、IP1的释放量以及ERK磷酸化的动态变化。结果：AβOs预处理导致激活细胞内M1胆碱受体其下游Ca²⁺和IP1的释放量减少、ERK被更快激活。结论：AβOs预处理导致激活M1胆碱受体下游关键信号分子释放水平、磷酸化水平异常,揭示在阿尔茨海默病早期M1胆碱受体便出现功能障碍,无法正确激活信号转导通路。     

β-淀粉样蛋白寡聚体对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞Munc-18表达的调节

为了观察阿尔茨海默病(AD)起始因素β-淀粉样蛋白(Aβ)对Munc-18表达的调节作用,采用Zn^2 诱导制备Aβ寡聚体,分化的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞经纳摩尔浓度Aβ寡聚体作用后用免疫印迹和流式细胞术的方法检测SH-SY5Y细胞的Munc-18蛋白水平,用MTT法分析纳摩尔浓度Aβ寡聚体的细胞毒性。结果发现,1nmol／L Aβ寡聚体作用1天后,SH—SY5Y细胞的Munc-18蛋白水平明显下调,随后逐渐增加。高浓度的Aβ寡聚体也有相似的作用效应,但抑制Munc-18蛋白表达的效应更明显。另外,相同浓度Aβ单体对Munc-18表达没有明显的影响,纳摩尔浓度的Aβ寡聚体也没有对细胞代谢产生显著的抑制。结果表明,纳摩尔水平Aβ寡聚体对Munc-18的表达有调节作用。     

假根羽藻外周天线色素分子间能量传递

假根羽藻外周天线捕光色素蛋白复合物(L ight-harvesting Comp lex II,LHC II)在不同聚集态的情况下,它所包含色素分子间的能量传递是不同的。采用荧光发射光谱和激发光谱技术对不同聚集态(单体、三聚体和寡聚体)的LHC II进行研究,发现三聚体中色素分子间的能量传递效率比较高,单体要小一些。520 nm激发下,类胡萝卜素分子向叶绿素a分子的能量传递效率:三聚体约为64%、单体约为56%;650 nm激发下,叶绿素b分子向叶绿素a分子的能量传递效率:三聚体约为89%、单体约为78%。寡聚体的能量传递要复杂些,从光谱分析出它包含两种不同吸收光谱特性的叶绿素b分子,吸收峰分别为480 nm和468 nm,其中蓝区吸收峰为480 nm的叶绿素b分子向发射685 nm荧光的叶绿素a分子的能量传递效率要小于75%。     

基于氨基酸组成分布的蛋白质同源寡聚体分类研究

基于一种新的特征提取方法——氨基酸组成分布,使用支持向量机作为成员分类器,采用“一对一”的多类分类策略,从蛋白质一级序列对四类同源寡聚体进行分类研究。结果表明,在10-CV检验下,基于氨基酸组成分布,其总分类精度和精度指数分别达到了86.22%和67.12%,比基于氨基酸组成成分的传统特征提取方法分别提高了5.74和10.03个百分点,比二肽组成成分特征提取方法分别提高了3.12和5.63个百分点,说明氨基酸组成分布对于蛋白质同源寡聚体分类是一种非常有效的特征提取方法;将氨基酸组成分布和蛋白质序列长度特征组合,其总分类精度和精度指数分别达到了86.35%和67.23%,说明蛋白质序列长度特征含有一定的空间结构信息。     

Tau蛋白寡聚体与阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（AD）是严重影响老年人健康的一种神经退行性疾病。AD主要两个病理特征是tau蛋白组成的神经原纤维缠结和β淀粉样蛋白组成的Aβ斑块。Tau蛋白是目前研究AD机制和防治药物的一个重要靶点。Tau蛋白的寡聚体形式被认为是最具神经毒性的,并且其能在神经元之间传播,诱导胞内的正常tau蛋白聚集。本综述结合近年来的文献报道,对tau寡聚体的制备手段、形成机理、神经毒性、传播机制以及治疗前景等方面做了系统总结和讨论,为人们深入认识tau寡聚体提供参考。     

人源性天然抗体库的构建及淀粉样蛋白Aβ1-42寡聚体单链抗体的筛选和鉴定

本研究旨在利用噬菌体展示技术构建人源性天然抗体库,以可溶性Aβ1-42寡聚体对抗体库进行筛选获得针对低分子量Aβ1-42寡聚体的特异性单链抗体.利用RT-PCR法从10个健康人外周血淋巴细胞中得到全套人抗体VH和VL基因,经过重叠延伸PCR将VH和VL连接得到scFv片段,将scFv片段酶切后克隆至pCANTAB5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,获得库容为2.5×109单链抗体库.经辅助噬菌体M13K07拯救,以可溶性Aβ1-42寡聚体为抗原,对抗体库进行4轮筛选,ELISA法筛选特异性识别Aβ1-42寡聚体的阳性克隆,将筛选到的阳性克隆B19转化至E coliHB2151菌,诱导表达可溶性scFv抗体.SDS-PAGE及Western blotting分析结果显示可溶性scFv抗体获得了正确表达,且能够与Aβ1-42三聚体及纤维特异性结合,亲和力(Kd)为9×10-6 mol/L.Aβ1-42寡聚体特异性单链抗体的获得为老年性痴呆(AD)的治疗研究奠定了基础.