yeaI基因对奶牛源大肠杆菌NJ17生物学特性的影响

c-di-GMP是细菌中广泛存在的第二信使,可通过效应蛋白参与调控细菌的生物被膜形成、运动性和毒力等生物学特性。YeaI因含有能结合c-di-GMP分子的EGEVF基序,可能作为c-di-GMP效应蛋白发挥作用。[目的] 研究yeaI基因缺失对奶牛源大肠杆菌临床分离株NJ17生物学特性的影响。[方法] 构建NJ17的yeaI缺失株（NJ17ΔyeaI）及回复株cNJ17ΔyeaI,分析yeaI对NJ17生物学特性（如生长特性、生物被膜形成能力和对小鼠乳腺上皮细胞（EpH₄-Ev）的黏附）的影响。[结果] 成功构建NJ17的yeaI缺失株（NJ17ΔyeaI）及其回复株（cNJ17ΔyeaI）;与野生株NJ17相比,缺失株NJ17ΔyeaI生长特性及耐药性无显著变化,生物被膜形成能力显著下降,运动性显著升高（P<0.05）;透射电镜检测结果表明,yeaI缺失影响NJ17菌毛和鞭毛的形成;实时定量PCR（qPCR）结果显示,yeaI基因显著抑制NJ17鞭毛基因filG和motB的转录水平（P<0.05）;血清杀菌实验表明,yeaI缺失能显著增强其抵抗血清杀菌作用（P<0.05）;对EpH₄-Ev细胞黏附实验表明,yeaI缺失对NJ17黏附性无显著影响（P>0.05）。[结论] yeaI对奶牛源大肠杆菌NJ17的生物学特性具有重要的调控作用。     

奶牛体细胞核移植胚胎产业化生产条件优化北大核心CSCD

通过优化高产奶牛体细胞克隆胚胎体外生产技术条件,制备高质量的奶牛克隆胚胎,旨在提高奶牛体细胞核移植产业化应用效率。就受体卵母细胞去核方法、不同年龄供体牛细胞来源、血清饥饿与否以及不同气相组成培养等条件对奶牛体细胞克隆胚胎生产效率的影响进行了研究和探讨。结果表明,虽然荧光染色辅助去核和盲吸法的去核率、囊胚发育率分别为100%、24.83%和92.44%、28.26%,两者之间无显著差异(P>0.05),但盲吸法操作简单、效率高;不同年龄来源供体牛的细胞系构建的克隆胚胎的囊胚发育率分别为31.43%、25.68%,两者之间没有显著差异(P>0.05);经血清饥饿和未饥饿供体细胞重构的克隆胚胎囊胚发育率分别为24%、29.9%,两者之间没有显著差(P>0.05);富氧和低氧气相培养的克隆胚胎的囊胚发育率分别为28.26%、31.55%,两者之间差异不显著(P>0.05),低氧气相组成更有利于囊胚的发育。根据上述结果,奶牛体细胞核移植胚胎(克隆胚胎)的产业化生产条件为:供体细胞无需进行同期饥饿处理,直接注入到盲吸去核后的受体卵子透明带下构建克隆胚胎,融合后的克隆胚胎在密封的混合三气(5%CO2-5%O2-90%N2)的气相组成下进行体外培养,能保持稳定的囊胚发育率。     

奶牛HSP70基因表达及其连锁微卫星标记与耐热性状的相关性

为了研究奶牛HSP70基因的mRNA表达规律和其紧密连锁的3个微卫星标记与耐热性状的相关性,文中在日平均温湿度指数(THI)为86.2(高温期)、70.9(临界高温期)和56.8(适温期)时分别采集10头处于同一泌乳阶段的同龄健康奶牛的尾静脉血,采用实时荧光定量RT-PCR技术分析不同条件下奶牛HSP70基因在外周血淋巴细胞的mRNA表达水平。结果表明:随THI升高,HSP70mRNA表达量呈上升趋势,高温期奶牛的外周血淋巴细胞HSP70mRNA表达丰度极显著高于临界高温期和适温期(P0.01),且与奶牛的耐热指标具有一定的遗传相关,表明HSP70基因可以作为奶牛热应激反应的候选基因。选取23号染色体上与HSP70紧密连锁的3个微卫星标记BMS468、BM1258和BM1815,用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析其在160头荷斯坦奶牛的遗传变异情况,利用最小二乘法拟合线性模型初步探索了这3个微卫星座位与奶牛耐热指标的关系。相关分析表明:耐热系数、红细胞钾含量及高温期日产奶量下降率的最有利基因型在BMS468基因座和BM1815基因座上,分别为134bp/128bp(P0.05)和186bp/148bp(P0.05);BM1258基因座上,最有利基因型101bp/99bp的高温期日产奶量下降率最低(P0.05)。     

泰州市奶牛乳房炎调查及其病原菌的分离

奶牛乳房炎是奶牛场的常发病和难以防治的疾病,为进一步了解引起奶牛乳房炎的病原微生物,本研究通过对泰州市3个奶牛场572头泌乳牛的乳房炎发病率进行了调查并对乳房炎主要病原菌进行分离和鉴定。结果表明,奶牛临床型乳房炎的发病率为7.69%,隐性型乳房炎发病率为56.64%,乳区阳性率为33.8%,其中临床型:隐性=1:7.36。从65份确定患有乳房炎的奶样中共分离获得8种细菌、156株分离株,且引起乳房炎的主要病原菌是金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌,其次是停乳链球菌、大肠杆菌、乳房链球菌和无乳链球菌,其检出率分别为42.31%、23.08%、8.97%、6.41%、5.13%和1.28%。该项调查结果初步明确了泰州市乳房炎发病情况,同时为进一步综合防治奶牛乳房炎和研制乳房炎治疗药物提供了科学依据。     

牛源隐孢子虫分离株的分子鉴定

目的对安徽4个牛源隐孢子虫分离株进行鉴定,旨在阐明感染牛隐孢子虫主要虫种。方法采用PCR和Nested-PCR方法分别对4个分离株18S rRNA、HSP70基因进行扩增和测序,所测定的序列经生物信息学分析它们同源性和构建种系发育进化树,以确定各分离株与其他隐孢子虫虫种之间的亲缘关系。结果 （1）它们的18S rRNA基因和HSP70基因与安氏隐孢子虫（C.andersoni）AY954887相似性可达88.3%和98.3%;（2）在遗传进化树方面,它们与AY954892（河南株）亲缘关系接近。结论此次分离的4个牛源隐孢子虫分离株均为安氏隐孢子虫（Cryptosporidium andersoni）。     

牛SRY蛋白表达纯化与体外功能鉴定

利用PCR技术从北京黑白花奶牛(Bostaurus)的基因组DNA中克隆了SRY(Sex-determiningregionontheYchromosome)基因编码区全长序列。序列分析表明牛SRY基因的HMG区(Highmobilitygroup)呈现高度的保守性,与人、小鼠、猪等的相似性达到70%。将SRY基因与pET-28a( )载体相连,构建表达载体pET-28a/SRY;把该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导30℃诱导4h,SRY蛋白可高效表达,表达产物占总蛋白量的26%。对表达产物进行了Western-blotting检测,并采用亲和层析技术获得了高纯度的牛SRY蛋白。通过PCR技术分别获得牛、人、鼠的苗勒氏管抑制物(MullerianInhibitingsubstances,MIS)启动子,凝胶阻滞试验证明,牛SRY蛋白可与人及牛的MIS启动子结合,但与鼠的Mis启动子不发生相互作用。     

我国奶牛乳房炎致病性金黄色葡萄球菌血清型分布

本试验采用玻片凝集法对从临床型乳房炎病乳中分离获得的56株金黄色葡萄球菌进行血清型分型。结果表明336型占67.9%(38/56),5型占7.1%(4/56),8型占3.6%(2/56)。     

奶牛乳房炎抗性候选基因的研究进展

乳房炎是奶业生产中的一种常见病,发病率很高,每年给世界各国奶牛饲养者造成严重的经济损失。乳房炎的影响因素很多,但遗传因素对其起着重要作用。综述了乳铁蛋白基因、MHC/BoLA基因、ToLL样受体家族基因、趋化性细胞因子受体基因、牛锌指蛋白313基因、β-防御素基因和热休克蛋白70基因等奶牛乳房炎抗性候选基因的研究现状。     

临床型乳房炎奶牛与健康奶牛嗜中性粒细胞差异蛋白质组的表达分析

嗜中性粒细胞是防止病原入侵的第一道防线,且已有研究表明嗜中性粒细胞在奶牛乳腺免疫中发挥着关键作用。文章运用双向凝胶电泳方法对临床型乳房炎奶牛与健康奶牛嗜中性粒细胞差异表达蛋白质组进行分析,成功获得分辨率较高、重复性较好的奶牛嗜中性粒细胞双向电泳凝胶图谱,并通过MALDI-TOF MS鉴定获得差异表达的蛋白质7种,主要涉及细胞代谢、氧化应激、炎症反应等相关蛋白通路。实验获得的临床型乳房炎奶牛与健康奶牛嗜中性粒细胞差异表达蛋白有望为今后奶牛乳房炎的抗病育种研究提供理论依据。     

DNA池快速筛查牛STAM1基因SNPs及估算等位基因频率

目的:旨在对不同牛种STAM1基因进行SNPs筛查,为地方牛种选种选育提供一定理论依据.方法:选取生长发育性状明显差异的务川黑牛和贵州荷斯坦奶牛2个牛种构建DNA池,设计1对引物分别扩增2个牛种STAM1基因第14外显子序列总长898bp.切胶回收后对PCR产物进行双向测序.结果:在牛STAM1基因中快速筛查到5个SNPs:A33C、C66G、C356T、T523A、T652C,其中A33C(Tyr→Ser)、C66G(Pro→Arg)、C356T(Glu→Lys)为错义突变,T523A为同义突变,T652C位于内含子区.贵州荷斯坦奶牛在T523A和T652C两个位点基因频率为1.0000,而务川黑牛分别为0.6730和0.8106.生物信息学分析表明:突变前后STAM1的RNA二级结构和蛋白质二级、三级结构均有明显改变.结论:DNA池结合测序技术可快速筛选SNP位点,检测到STAM1基因第14外显子5个SNPs.