乙型脑炎病毒NS2A-C60A位点突变对其生物学特性影响研究*

目的:旨在探索Ⅰ型日本乙型脑炎病毒传代致弱后基因组突变NS2A-C60A对乙脑病毒生物学特性的影响。方法:首先通过对传代致弱及原始乙脑毒株基因组序列进行测序比对、结构预测分析并利用Western blotting(WB)确定了目标研究位点NS2A-C60A;然后使用反向遗传定点突变技术构建拯救了包含NS2A-C60A单点突变的病毒株;最后利用噬斑形态观察、生长曲线、双萤光素酶分析,WB以及炎性因子检测和动物实验研究了该单点突变对于乙脑病毒生物学特性的影响。结果:首次研究发现Ⅰ型乙脑病毒传代致弱会导致NS1'蛋白表达的显著下降以及可能的相关位点NS2A-C60A,并成功拯救获得了NS2A-C60A单点突变毒株rJEV-C60A,研究发现NS2A-C60A突变对乙脑病毒的生长特性及噬斑形成没有显著影响,但是能够显著降低乙脑病毒NS1'蛋白的表达,并且该位点突变能够轻微阻碍乙脑病毒对细胞炎性因子表达的抑制,动物实验结果显示NS2A-C60A点突变病毒与原毒株具有相似的神经毒力,说明该位点突变不是影响乙脑病毒毒力致弱的关键位点。结论:新发现的NS2A-C60A位点突变能够显著减少乙脑病毒NS1'蛋白的表达,但是对其增殖、诱导炎症及神经毒力等生物学特性没有显著影响。     

介绍一种新的表皮细胞传代方法

我们设计了一种新的传代方法,在传代之前,先用 DispaseⅡ酶,将培养的表皮细胞片整个消化下来,再用0.25—0.3%胰酶冷消化将表皮细胞驱散,进行1:2传代获得成功,传代59次成功率为71.2%。若在培养后7—16天传代,成功率可达80%。本文讨论了此种传代方法比单纯用胰蛋白酶或用胰蛋白酶和EDTA 混合传代方法优越。     

H1N1流感病毒在微载体培养MDCK细胞上增殖的研究

目的探索MDCK细胞在微载体上的培养条件,并研究H1N1型流感病毒在MDCK细胞上的增殖条件。方法在微载体上培养好MDCK细胞上用H1N1型流感病毒在不同的病毒感染复数(MOI)、胰酶浓度两个关键的病毒增殖条件进行流感病毒在细胞上的增殖研究。结果微载体质量浓度为6 g/L时,MDCK细胞培养密度可以达到4.5×106cells/mL。在MOI为0.05接种流感病毒,胰酶质量浓度4μg/mL,流感病毒在MDCK细胞上可获得较高的滴度。结论 MDCK细胞用微载体培养可以达到较高的细胞密度,可以作为规模化生产新型流感病毒疫苗的主要细胞基质进行进一步的研究。     

鼠体突变型p53外源基因的垂直传递和转位观察

外源基因用于制作转基因鼠并能成功地传递到子代已是不争的事实。但是,有关研究转基因的大小以及对其功能的影响却鲜见报导。本实验对体突变型p53基因－作为外源基因在172^Arg-Leu－体突变型p53基因的双转基因鼠家系中的遗传行为进行了研究。以体突变型p53基因的XhoI-ApaLI片段为探针,对雌性双转基因鼠＃4491及其子代进行Southern blot分析（Fig.2)。通过Betagen Meter测定,比较杂交膜上探针的吸附量得知：子鼠＃5074等体内的外源p53基因的拷贝数是其亲本34491的3倍。Fig.1为＃4491与雄性FVB鼠杂交后代的家系谱。杂交F1的子代中,那些外源p53基因拷贝数是其亲代（F1）3倍的鼠（如＃5071和＃668）、其后代中继续出现这种基因拷贝数的变化。取待测鼠＃5074的脾细胞制备染色体,经G染色,以WAP－双转基因－SV40连结p（A）的结构为探针,进行原位荧光测定。Fig.3表明：b所指的外源p53基因从所在的染色体上发生跳跃（jump in),出现在c和d所指的位置上。可能,整合在＃4491染色体上的外源p53基因有两组,一组是稳定整合的,传代时,可以被传递到所有子代上;另一组是非稳定整合的,由于一些未知因素,在传递过程中被扩增、并发生了跳跃现象。也许,特定位点上转基因的拷贝数有一个限量,适量则稳定;反之、则不稳定。     

间充质干细胞长期传代培养条件的研究

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是存在于成体组织间质部分的多能前体细胞,在体外具有自我更新增殖及向成脂、成骨、成软骨分化的潜能,在组织工程和细胞治疗方面具有广阔的应用前景。MSCs在体外长期培养获得足够数量的细胞是MSCs应用的一个重要因素。然而,目前还没有建立MSCs长期传代培养的最适培养体系。该文分别从培养体系中的基础培养基、血清和生长因子对于MSCs细胞长期传代培养的影响进行了论述,旨在为建立MSCs体外长期传代生长的最适培养体系提供理论依据。     

多次采血对Wistar大鼠脏器系数的影响

目的研究不同时间间隔经眼眶静脉丛多次采血后,对雄性Wistar大鼠重要脏器系数的影响。方法实验组分别间隔3 d、7 d、10 d,经眼眶静脉丛采血,每次采血1 mL,共采3次。对照组于实验组最后一次采血时采血一次,采血1 mL。每次采血前称量体重,于最后一次采血后将大鼠处死,取心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胸腺,称量脏器重量,计算脏器系数。结果间隔3 d多次采血,大鼠的肝、肾系数差异具有显著性（P〈0.05）,间隔7 d、10 d多次采血,大鼠的各脏器系数差异无显著性。结论间隔3 d多次采血对大鼠的肝、肾系数有影响,间隔7 d、10 d多次采血对各脏器系数均无影响。     

SHIV-XJ02170感染恒河猴后期的传代特点和env基因变异

目的研究SHIV-XJ02170在中国恒河猴感染后期传代过程中病毒和宿主的变化特点,并分析env基因的序列变异。方法将感染中国恒河猴G0401V后期（5年）的SHIV-XJ02170病毒垂直传代2只猴（G0401V→G0402V→0403V）,同时,剔除G0401V猴CD8＋T细胞使潜伏的病毒大量复制后传代1只猴（G0401V→G0404V）,应用流式细胞术、病毒载量测定、序列分析等方法研究该病毒在猴体内长期适应后的病毒和免疫学指标及序列变异特点。结果 G0401V在感染后期仍能稳定传代,且表现出毒力增强的特点。其传代猴G0402V在传代后41 d死亡,外周血CD4＋T淋巴细胞衰竭,仅为43个/mL,符合艾滋病感染猴快速进展型的特征。剔除体内CD8＋T细胞之后的传代猴G0404V的表现类似G0401V,即长期低水平的病毒血症水平。env基因序列分析发现SHIV-XJ02170在G0401V体内长期适应后发生了可遗传的序列变异,并引起糖基化位点的改变。结论 SHIV-XJ02170在猴体长期适应后的传代过程中表现出向强毒株过渡的特征,为进行SHIV-XJ02170感染性克隆的构建奠定了良好的实验基础。     

采用多次顶空固相微萃取分析拟南芥绿叶挥发性物质

顶空固相微萃取作为一种新的挥发性和半挥发性物质分析技术,被广泛应用于植物样品的定性分析。由于进行顶空分析时,挥发性组分间的基质效应以及较为复杂的扩散和吸附过程,定量分析一直是SPME分析应用的难题。目标分析物的量看作是达到吸附平衡后单一萃取的物质量的总和,则无需考虑分析样品在顶空、萃取涂层间的分配,同时可以消除基质效应。在利用标准物质进行校正后只需要一次顶空萃取,即可求出分析物质的总量。首先利用DVB/CAR/PDMS定性得到拟南芥挥发性物质的组成,然后采用CAR/PDMS涂层定量,分析了拟南芥的3种绿叶挥发性物质,优化后萃取条件为40℃萃取20min,相对标准偏差小于12%,在3株植物样品中这些挥发性物质的量为78.6~158.4ng.g-1。     

胰岛素样生长因子(IGF-1)重组菌株的稳定性试验

胰岛素样生长因子 (Insulin LikeGrowthFactor,IGF 1)重组菌株 pCST/IGF/W310 0 ,在含Tet 5mg/L的LB培养基平板上划线传代培养 10 0代 ,经对其表达水平、质粒性状及遗传稳定性、染色体特性等一系列检定后 ,其结果表明均与原始菌种一致 ,且无支原体及其他微生物污染 ,为其规模化生产奠定了基础。     

影响小鼠体细胞脂质体法转染效率的因素

We studied the effects of the amount of liposome and plasmid, exposure time of cells to the liposome-plasmid complexes, number of cell passages and cell types on GFP gene transfection of mouse somatic cells. The maximal GFP transgene expression (30.7%) was achieved when mouse fetal fibroblast cells (MFFC) at 70%-90% confluence of passage 3 were exposed for 6 h to the complexes of 4 microg liposome (LipofectAMINE) and 0.3 microg plasmid (pEGFP-N1). Under these conditions, we compared the effect of the number (from primary to 15) of passages on the transfection efficiency of MFFC. The transfection efficiency of MFFC was 10.0%, 28.9% and 7.2% at the primary, 3rd and 15th passage, respectively, which indicated that the transfection efficiency decreased with passaging. When MFFC, mouse oviductal epithelial cells (MOEC) and mouse granulosa cells (MGC) were transfected at passage 3, the transfection efficiency was 27.8%, 13.7% and 14.2%, respectively, under the described transfection conditions. When the cell cycle stages of different cell types at transfection were examined, it was found that 17.2% of MFFC, 8.7% of MOEC and 9.9% of MGC were at M phases of the cell cycle. Examination of the cell cycle stages of MFFC at different passages showed that MFFC at the third passage had the highest percentage of M cells and the percentage decreased afterwards. This suggested that the transfection efficiency was correlated with the percentages of cells at M phase, and provided essential data for improvement of the transfection efficiency.