外显子与内含子序列分维的双碱基研究

引入碱基间的关联,研究了外显子和内含子序列以双碱基为单位的分维,我们发现在这种情况下,外显子和内显子序列在短程和中程存在自相似性并分别定义了这两个区域的分维。结果表明,短程的分维值Ｄｇ一般比中程的Ｄｍ大,外显子的两个分维值比内含子大。我们改变双联体的位相而分维却不变,这反映出在双联体基础上,外显子的不规则性大于内含子,短程的不规则性大于中程,外显子和内含子序列对以２为周期的结构没有位相的特异性。     

外显子和内含子的序列复杂性

引入了两个新的关于序列复杂性的测度,并以此为指标分析比较了结构基因序列中的外显子和内含子的复杂性差异。     

豚鹿MHC-DOA基因克隆及其外显子2遗传多样性研究

主要组织相容性复合物(MHC)在脊椎动物的免疫系统中起着重要的作用,MHC-DOA基因是MHCⅡ类的非经典基因,其外显子2多态性丰富。豚鹿Axis porcinus是我国极度濒危的动物。本研究以成都动物园圈养的38头豚鹿为研究对象,提取豚鹿血液总RNA,反转录合成cDNA为模板,利用PCR方法克隆到豚鹿MHC-DOA序列;同时利用PCR方法扩增38头豚鹿的MHC-DOA基因外显子2基因并测序,再进行多态性分析。结果显示:豚鹿MHC-DOA基因开放阅读框长753 bp,编码250个氨基酸残基;蛋白质同源性分析表明,豚鹿MHC-DOA基因与东欧马鹿Cervus elaphus hippelaphus的同源性最高(98.4%);38头豚鹿的MHC-DOA外显子2共有10种单倍型,整体遗传多样性水平中等;MHC-DOA外显子2部分序列中发生了核苷酸的缺失和插入,进而引起DOA蛋白序列发生改变。豚鹿MHC-DOA多态性的研究对豚鹿种群遗传结构调查、遗传资源的保护具有重要意义。     

不依赖天然外显子的蛋白质内含子定向进化筛选系统

蛋白质剪接技术为在蛋白质水平上直接对蛋白质进行修饰和加工提供了一种全新的解决方案,因而在蛋白质工程及相关领域具有非常广阔的应用前景。现阶段,大部分天然的蛋白质内含子在异源蛋白质中剪接活性非常低,极大限制了蛋白质内含子的开发和应用。为了开发一个可以同时对蛋白质内含子通用性和剪接活性进行筛选的系统,利用Bsa I限制性内切酶识别位点和切割不重合的特性,将Ter ThyX内含子(不含外显子序列)插入到卡那霉素抗性蛋白基因的多个位点。并且摒弃了以往需要结合天然外显子以实现剪接的方法,可以同时对蛋白质内含子的剪接活性和通用性进行筛选。Western blot结果和卡那霉素平板生长结果表明,通过卡那霉素筛选系统可以精确的将蛋白质内含子剪接反应与卡那霉素抗性结合起来,仅从卡那霉素平板上的菌落生长情况即可完成蛋白质内含子剪接活性阳性突变的筛选,是一个快速,稳定的定向进化筛选系统。     

应用全外显子测序和显微切割技术识别1 例肺癌患者高频突变基因的异质性探索

目的:通过对一例肺鳞癌患者全外显子测序来识别这例肺癌的可能致病基因,并通过显微切割初步探索这例肺癌肿瘤细胞的起源与演化。方法:利用全外显子测序技术对肺癌肿瘤组织和相应癌旁组织测序;用COSMIC肿瘤数据库比较分析统计出肺癌可能致病基因;用激光显微切割技术提取五个不同部位肿瘤细胞;巢式PCR扩增,一代测序验证基因分型。结果:发现了这例肺癌病人的7个高频突变基因:LPHN2、TP53、MYH2、TGM2、C10orf137、MS4A3和EP300;这些基因在10×镜下和20×镜下经显微切割的肺癌组织的5个不同部位上的基因分型不同。结论:我们通过全外显子测序发现了这例肺癌的7个可能致病基因,并初步探索了这例肺癌肿瘤细胞是多克隆起源的。     

基因外显子连接序列与相应内含子序列的相互作用

剪接后的内含子与相应mRNA序列的相互作用在基因表达调控过程中起着非常重要的作用。基于27个物种的核糖核蛋白基因序列,采用Smith—Waterman局域比对方法得到外显子连接序列与相应内含子序列的最佳匹配片段,分析了外显子连接序列上的匹配频率分布和匹配片段的序列特征。发现一些低等真核生物EJC结合区域的匹配频率明显低于其它区域,所有物种EJC结合区域的序列构成呈现出相对低的结构序。最佳匹配片段的平均长度和配对率分布与siRNA和miRNA的结合特征相同。推测EJC和内含子在与外显子序列结合的过程中存在相互竞争和相互协作的关系,内含子中部序列在基因表达调控过程中起着重要的作用。     

DMD/BMD缺失基因的检测及其表达产物的变化

目的:检测Duchenne/Becker型肌营养不良症(DMD/BMD)患者基因缺失及其表达产物--抗肌营养不良蛋白在肌细胞中的变化,探讨其与临床病情的关系.方法:应用9对引物多重PCR技术对42例DMD/BMD患者进行基因检测;并采用免疫荧光抗体染色技术对5例DMD,2例BMD肌细胞膜上抗肌营养不良蛋白的表达观察分析,以2例正常人的肌组织作为对照.结果:共发现21例外显子缺失,缺失片段长度各异,其中16例(76.2%)累及中央缺失热区,5例(23.8%)位于5'端缺失热区,尤以48号外显子缺失频率最高.5例DMD患者胞膜抗肌营养不良蛋白染色阴性,其中1例未检出基因缺失,但抗肌营养不良蛋白无表达.2例BMD患者染色弱阳性,可见间断斑片状荧光带.结论:DMD/BMD病情轻重可能与基因缺失的数量和片段大小不呈平行关系,而是与外显子的缺失类型有密切关系;基因的表达受个体差异的影响,呈高度的遗传异质性.抗肌营养不良蛋白缺乏或表达异常是造成DMD/BMD表型的病理基础,其临床后果不仅取决于缺失程度,还取决于缺失区域的功能意义.     

利用RT-PCR技术验证基于小鼠外显子芯片发现的缺血相关基因的表达

目的:利用RT-PCR技术验证并确认基于小鼠外显子芯片发现的部分缺血相关基因的表达,以鉴定候选基因的外显子是否发生可变剪接,从而实现对外显子芯片结果的鉴定。方法:根据生物信息学分析结果,选取小鼠外显子芯片中的3个基因(Ube3c,6330439K17Rik,Atp7a),在预测发生可变剪接的外显子两侧设计上下游引物,PCR后进行凝胶回收,再克隆到载体中进行测序。结果:RT-PCR及测序结果表明,Ube3c基因在6号外显子、6330439K17Rik基因在12号外显子、Atp7a基因在3号外显子发生可变剪接,与芯片预测结果一致。结论:RT-PCR技术可针对外显子芯片的结果进行可靠性验证,为可变剪接基因表达研究提供了一种有效手段。     

7型腺病毒E1A基因克隆及真核表达

为了研究7型腺病毒(Ad7)E1A在感染中的致病机制,分离了Ad7d2病毒株,构建了Ad7 E1A基因的真核表达体系.用A549细胞分离培养痰液标本中的腺病毒,应用重叠延伸PCR扩增Ad7 E1A基因外显子,产物克隆至真核表达载体pIRES-Neo,构建重组子pIRES-Neo-Ad7E1A并转染A549细胞,利用Western印迹对其表达产物进行鉴定.克隆测序显示扩增的Ad7 E1A基因外显子包含了完整的编码区基因,pIRES-Neo-Ad7E1A转染A549细胞的表达产物经Western印迹鉴定与设计相符.成功建立了Ad7 E1A 基因的真核表达体系.     

小麦黄色素合成途径中Psy基因的克隆及分子特性

对普通小麦(Ttiticum aestivum)黄色素(YP)合成途径中的首要限速酶——八氢番茄红素合成酶(Psy)基因进行克隆和测序,并和玉米Psy基因进行序列比对。结果表明,在高和低YP含量小麦品种中均扩增出一条长1192bp的Psy基因片段,该片段包含一条可编码78个氨基酸的小麦Psy基因的外显子,与玉米Psy基因第4外显子的核苷酸序列同源率为80.74,同源区域内有47个SNPs,但仅11个SNPs导致氨基酸编码序列的改变,二者氨基酸序列的同源率达85.89,推测Psy基因在不同物种中的表达具有较高的保守性。BLAST聚类分析表明,禾谷类植物Psy基因的分类与物种的亲缘关系存在明显的相关性,小麦Psy基因在系统进化中比禾谷类其他植物更为高级。