裂解多糖单加氧酶高效催化的研究进展

裂解多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMOs)是一类新发现的铜离子依赖性的氧化酶,常具有多种模块化组合,能够高效氧化降解生物质多糖.LPMOs的催化结构域为β三明治结构,活性中心含有一个铜离子.该酶的催化反应过程相对于糖苷水解酶类更加复杂,LPMOs结合底物后,首先要接受电子供体提供的电子,通过电子传递链传递给活性中心的Cu[Ⅱ],将其还原为Cu[Ⅰ],Cu[Ⅰ]结合并活化分子氧后,再氧化降解多糖链的糖苷键,生成氧化产物和非氧化产物.近年来的研究表明,在木质纤维素降解酶系中加入LPMOs能显著提高其对结晶纤维素的转化效率,因此LPMOs相关研究的深入开展可以拓展人们对其高效降解机制的认识,从而为高效降解酶系的复配以降低工业规模的生产成本等提供理论指导.本文综述了该领域相关研究的最新进展,分析了LPMOs潜在的研究方向与工业化应用的前景.     

嗜热革节孢多糖单加氧酶氧化方式

多糖单加氧酶(polysaccharidemonooxygenase,PMO)是一种铜离子依赖的氧化酶,属于辅助活性酶类第九家族(auxiliary activity 9,AA9),在存在电子供体维生素C(vitamin C,Vc)的情况下,可以氧化裂解纤维素的多糖链,显著提高纤维素的酶解效率。本文克隆了嗜热革节孢Scytalidium thermophilumAA9家族的一个编码基因pmo7651,并在毕赤酵母GS115进行诱导表达,通过His标签获得了重组蛋白PMO7651-His。以磷酸膨胀纤维素(PASC)为底物进行酶促反应,薄层层析法(TLC)结果显示PMO7651酶解产物主要为纤维二糖至纤维五糖;飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)和溴氧化法确定PMO7651具有C1、C4、C6位的氧化活性;底物结合平面的3个芳香族氨基酸位点突变对酶的活性具有不同程度的影响;在PMO7651帮助下,纤维素酶的降解效率均具有不同程度的提高。     

辽宁碱蓬胆碱单加氧酶(CMO)基因启动子分离及功能元件分析

根据已知的辽宁碱蓬CMO cDNA 5′端序列设计两个基因特异的反向引物(CR1,CR2),通过衔接头PCR获得了CMO基因起始密码子上游498 bp的序列。根据所获得的序列设计两个基因特异的反向引物(CR3,CR4),用CR2、CR3、CR4分别与4个简并引物配对,通过TAIL-PCR扩增,获得了约2 kb的序列。经Sequencer软件拼接上述两段序列,获得了CMO基因起始密码子上游2,332 bp的序列。用TSSP-TCM软件分析此序列,预测出转录起始点(C)位于起始密码子上游128 bp处,由此我们获得了2,204 bp的SlCMO启动子序列。用PLACE软件分析此序列,发现该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box,包含多个胁迫诱导元件,如盐诱导元件GAAAAA,冷胁迫诱导元件CANNTG,ABA 响应因子NAACAA,水胁迫元件CGGTTG和伤害诱导元件GTTAGGTTC等,是一个强的胁迫诱导启动子。辽宁碱蓬胆碱单加氧酶基因盐诱导启动子的获得,为盐诱导启动子功能元件分析提供了可能,为进一步研究启动子结构与功能的相互关系、CMO基因的表达调控机制奠定了基础。     

氨氧化古菌及其对氮循环贡献的研究进展

硝化作用先将氨氮氧化为亚硝酸盐氮并进一步氧化为硝酸盐氮,这一过程是氮进行全球生物化学循环的重要环节。随着氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)基因组序列中氨单加氧酶编码基因(amoA)的发现以及AOA在实验室条件下的成功培养(包括分离纯化和富集培养),基于分子生物学的研究表明AOA在各种环境广泛存在,且多数生境中它的数量远远超过氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria,AOB)。AOA相对于AOB在氮循环中的贡献也引起了多方面的论证和争论。本文就氨氧化古菌的生态分布、系统进化、生境存在丰度及参与硝化作用等进行综述,指出不同生境AOA的活性及其对氮循环的重要性仍需做进一步的研究。     

伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)2-萘酸单加氧酶基因(nmo)的克隆及表达

通过酶切连接将Burkholderia sp．JTl500的一段DNA片段(4．8kb)亚克隆到表达载体pUC18上,得到重组子pEKl23。测序后的pEKl23重组子4．8kb插入片段的序列已经登陆欧洲EMBL基因库,序列接受号为AJ566333。对这一DNA片段的序列分析显示,此DNA片段含有3个阅读框,且在这3个阅读框5’端发现一启动子特异序列。再用酶切连接方法得到仅含一个阅读框的重组子pXK3,其阅读框长度为1158bp,编码386个氨基酸,与已报道的Ralstonia eutropha HF39羟化酶(单加氧酶,bec)氨基酸序列有64％的同源性。pEKl23对2-萘酸代谢途径中4个关键底物的转化实验结果显示,其基因产物仅对2-萘酸发生加氧转化反应,而且2-萘酸浓度有明显的降低,证实此基因是2-萘酸单加氧酶基因(nmo)。同时发现其基因产物也可以转化苯甲酸钠。该酶对苯甲酸的加氧转化途径正在研究中。SDS-PAGE结果表明,pXK3、pEKl23两重组子中2-萘酸单加氧酶表达量并没明显区别,但加氧酶酶活却存在显著的差别。推测在启动子后,单加氧酶阅读框前的两个阅读框的基因产物,对单加氧酶活有促进作用。     

棉酚和烟碱对棉铃虫的生长和细胞色素P—450单加氧酶活性的影响

以人工饲料添加测定了0．5％的棉酚和烟碱对棉铃虫的生长和细胞色素P－450单加氧酶（简称P－450酶系）活性的影响。研究结果显示,在测定浓度下,高龄棉铃虫短期取食含棉酚和烟碱的人工饲料后,对幼虫的生长没有显著影响,由此表明,棉铃虫对其主要寄主植物中的次生物质棉酚和烟碱具有很好的适应能力。与此同时,棉铃虫中肠微粒体P－450酶系的蛋白组成和酶活性发生了不同的变化,有升有降,有的没有变化。棉铃虫可能通过调整P－450酶系的各种蛋白含量和酶的活力水平,来适应对植物次生物质的代谢解毒的需要。另外,棉铃虫取食棉酚和烟碱后,细胞色素B5含量均显著提高,而细胞色素P－450含量均显著降低,细胞色素B5在棉铃虫对棉酚和烟碱的解毒代谢中可能发挥着更为重要的作用。     

飞蝗解毒酶系活力测定方法

飞蝗Locusta migratoria是重要的农业害虫,代谢抗性是飞蝗主要的农药抗性机制之一。与代谢抗性相关的解毒酶系主要有:非专一性酯酶系(Non-specficesterases,ESTs)、谷胱甘肽S-转移酶系(Glutathione S-transferases,GSTs)和细胞色素P450单加氧酶系(Cytochrome P450 monooxygenases,P450s),解毒酶系活力的测定是研究飞蝗农药代谢机制的重要途径。本文详细介绍了飞蝗解毒酶系的测定方法,为蝗虫及其他昆虫解毒酶系的测定提供参考。     

辽宁碱蓬SlCMO基因盐胁迫表达分析及盐诱导启动子鉴定

胆碱单加氧酶（choline monooxygenase, CMO）是合成甜菜碱的关键酶,甜菜碱在植物抵抗渗透胁迫中起着重要的作用。本研究室前期克隆了盐生植物辽宁碱蓬CMO（Suaeda liaotungensis CMO）基因及启动子。本研究对SlCMO基因在盐胁迫下的表达及盐诱导启动子进行分析。qRT-PCR分析SlCMO基因在辽宁碱蓬不同器官及盐胁迫下的表达,结果表明,SlCMO基因在根、茎、叶中均有表达,其中茎、叶中的表达量较高,SlCMO基因在根、茎、叶中的表达均受盐胁迫诱导。5′端缺失分析SlCMO启动子的盐诱导区段,结果表明,pC5（-267~+128 bp）是SlCMO启动子的盐诱导功能区段,推测pC5调控SlCMO 基因的盐诱导表达。本研究为SlCMO 基因表达调控研究奠定基础,也为植物抗盐基因工程提供可用的启动子。     

植物三萜皂苷生物合成中关键后修饰酶研究进展

三萜皂苷是由三萜苷元、糖基、糖醛酸等组成的C30萜类化合物,是许多药用植物的主要活性成分,具有广泛的药理作用。三萜皂苷的生物合成包括前体和三萜皂苷骨架的形成以及调控皂苷结构多样性的后修饰。三萜皂苷的后修饰包括三萜骨架的氧化/羟基化和糖基化,分别由不同超基因家族编码的细胞色素P450单加氧酶和糖基转移酶进行催化。三萜皂苷通过后修饰最终可形成多种单体皂苷。目前,已在少数植物中识别和确认了个别与三萜皂苷生物合成相关的关键后修饰酶,发现了部分很可能参与后修饰过程的候选基因。该文就近年来国内外有关三萜皂苷生物合成途径关键后修饰酶的研究进行综述,为进一步开展相关研究和对合成精细途径的解析提供参考。     

微粒体多功能氧化酶系与棉铃虫对氰戊菊酯抗药性的关系

测定了棉铃虫Helicoverpa armigera抗氰戊菊酯种群及相对敏感种群不同组织微粒体的甲氧试卤灵-O-脱甲基酶、乙氧试卤灵-O-脱乙基酶、乙氧香豆素-O-脱乙基酶、芳烷基羟基化酶和艾氏剂环氧化酶的活性。结果表明：抗性种群棉铃虫中肠组织的这5种酶活性分别比敏感种群的活性提高了11.29、4.10、2.66、6.30和2.34倍,其脂肪体及体壁的相应酶活性则分别为敏感种群的1.46、6.80、1.36、4.05、1.48倍和12.32、2.2、1.33、0.80和0.51倍。两种群中,棉铃虫不同组织部位的各单加氧酶活性均不同,活性高低顺序在两种群间也不同。总体而言,均是中肠或脂肪体微粒体对不同底物的氧化代谢能力最强。