双单抗的免疫层析一步法用于早妊诊断的研究

在试管式、微孔式和斑点式的酶免测定法测定人绒毛膜促性腺激素（ＨＣＧ）的基础上,发展了应用双单克隆抗体的免疫层析一步法测定ＨＣＧ。此法用胶体金标记抗βＨＣＧ单克隆抗体,将抗αＨＣＧ单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上。无需分离步骤,特别是在进行测定时除加入样品外无需再加任何试剂,此方法特别迅速、简便,２～５ｍｉｎ即可得结果。凡ＨＣＧ浓度＞２５ＩＵ／Ｌ的样品可得到阳性结果。在人体血或尿中可能出现的高浓度的干扰物质,如抗坏血酸、乙酰水杨酸、雌二醇、蛋白质、胆红素、甘油三酯等对本测定均无干扰作用,在促黄体激素（ＬＨ）浓度高达５００ＩＵ／Ｌ时仍与ＨＣＧ没有交叉反应。能进行测定的最高值大于３００ＩＵ／ｍｌ,这表示,当ＨＣＧ浓度达到妊娠期的最高值时仍不会有假阴性结果。     

新疆伊犁地区马匹亨德拉病毒脑内感染情况调查

目的检测新疆伊犁地区天然牧场放养马群脑组织中亨德拉病毒（Hendra Virus,HeV）的核酸片段,调查该地区马群中枢神经系统HeV感染流行状况。方法针对HeV高度保守区核蛋白（N）基因设计特异性引物和探针,采用一步法实时荧光定量RT-PCR检测中枢神经系统感染样本中低浓度HeV RNA的方法,检测新疆伊犁草原地区天然放养且未接种HeV疫苗的183例马匹脑组织。结果最低特异性检出浓度可低至2.6×102copies/μL,与其他单股负链RNA病毒如同属的尼帕病毒（NiV）无交叉反应,对183例马脑组织进行一步法实时荧光定量RT-PCR检测,未检出阳性样本。结论初步流行病学研究尚未发现我国新疆伊犁地区天然牧场放养马匹中存在HeV感染的证据,提示该地区短时间内爆发亨德拉病毒感染的可能性小。     

固相放射免疫分析一步法检测HBsAg试剂的研究

采用位点配对法筛选单克隆抗体,研制固相放射免疫分析一步法检测HBsAg药盒,对此药盒的各项性能指标及临床应用进行了全面的考核。实验证明,其为临床检验,尤其血源筛选,保证输血血液及血液制品的质量,切断乙型肝炎输血传染提供了技术上的保障。     

大学新生戊型肝炎病毒现／近期隐性感染的筛查

为了解大学新生戊型肝炎病毒(HEV)现／近期隐性感染的状况,探讨引起隐性感染与急性戊型肝炎(HE)的HEV毒株间有无差异,本实验利用ELISA一步法检测了正常大学新生血清标本中抗—HEV IgM,对抗—HEV IgM阳性者检测抗—HEV IgG,并进行HEV逆转录一巢式PCR（RT-nPCR)。结果 2223份血清中抗—HEV IgM阳性18份,阳性率0．8％,P/N值在2．0—3．0之间。17份标本抗—HEV IgM、IgG同时阳性,1份抗—HEV IgM单独阳性,但用RT-nPCR检测抗—HEV IgM阳性标本,HEV RNA均阴性。提示正常大学新生中存在HEV现/近期隐性感染,应注意感染者作为传染源的可能性;HEV隐性感染时,产生的抗体滴度或亲和力较低,病毒血症时间短,病毒滴度低,或毒株的基因序列与引起急性HE的毒株的序列有一定差异。     

两种提取蒙古黄芪miRNA方法的比较

通过对两种miRNA提取方法——一步法和多步法进行比较研究,以期获得较高质量的蒙古黄芪不同器官的miRNA。实验结果表明,两种方法均可用于蒙古黄芪miRNA提取,二者存在着不同的优缺点,多步法提取成功率较高但步骤繁琐,相比之下一步法实验条件要求严苛但步骤简单、快捷省时,提取的蒙古黄芪miRNA完整性好,可以满足荧光定量PCR等进一步实验需要。     

一步法提取植物DNA用于大规模RAPD分析

ＲＡＰＤ技术已广泛地用于植物的系统演化、种群多样性、群体遗传学及杂种种子纯度的鉴定等工作中〔１～３〕。本文基于快速节省的原则对碱液法提取植物ＤＮＡ进行一些改进。１材料与方法ＤＮＡ提取方法取１０～２０ｍｇ幼叶 ,加１００μｌ０ ５ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ（或附加０ ５ %～１ ５ %巯基乙醇）研磨后 ,取４０μｌ研磨液加入２００μｌ１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ ＨＣｌｐＨ７ ６缓冲液（或附加０ ５%不溶性聚乙烯吡咯烷酮 ,ＰＶＰ）中 ,８０００×ｇ离心５ｍｉｎ,上清液即可用于ＰＣＲ反应。ＰＣＲ反应体系含１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉ…     

马铃薯病毒一步法多重RT-PCR检测技术的构建

根据马铃薯病毒PVX、PVY、PVA、PLRV的CP基因序列设计4对特异性引物,通过对试剂浓度和反应条件进行优化,建立了能够同步检测PVX、PVY、PVA、PLRV的一步法多重RT-PCR检测方法。该方法对PVX、PVY、PVA、PLRV扩增出的靶带大小分别为732、422、132和336 bp,凝胶电泳易辨别区分。病毒RNA最低检测限度为7.8 pg/μL,对PVM、PVS、AMV、TMV及PSTVd的扩增为阴性。研究结果表明,该方法特异、灵敏,比两步法多重RT-PCR检测更加快速、简便,提高了检测效率,降低检测成本,为马铃薯病毒的高效检测提供了有效手段。     

DNA聚合酶iota在HEK-293细胞中高表达体系的建立

目的:将带有DNA聚合酶iota(DNA Polymerase iota,Polι)目的基因的真核表达质粒PCDNA3.1转入HEK-293细胞,建立DNA聚合酶iota在HEK-293细胞中的高表达体系,为进一步研究DNA聚合酶在DNA损伤修复中的生物学功能奠定了基础.方法:用脂质体2000(Lipofectamine2000)将带有目的基因的真核表达质粒PCDNA3.1转入HEK-293细胞,通过G418筛选抗性克隆,用一步法提取细胞总RNA,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测出高表达克隆.结果:通过G418筛选筛选出了具有G418抗性的克隆,通过RT-PCR技术检测出高表达DNA聚合酶iota的HEK-293细胞系.结论:建立了高表达DNA聚合酶iota的HEK-293细胞系.为进一步研究DNA聚合酶在DNA损伤修复中的生物学功能奠定了基础.     

三七总RNA提取方法的对比研究

比较利用改进的异硫氰酸胍一步法、异硫氰酸胍高盐法、CTAB法和Thomas’RNA提取法等4种方法提取三七根茎2个部位总RNA的可行性。结果表明,改进的异硫氰酸胍一步法和异硫氰酸胍高盐法能有效地抑制酚类物质、多糖及皂苷等次级代谢产物对总RNA的影响,可从三七根茎中获得质量高、完整性好的总RNA。RT—PCR分析显示提取的总RNA具有反转录活性。这2种方法具有快速、简单、有效的特点。     

以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸整合型重组钝齿棒杆菌的构建

[目的]为了构建一株直接利用廉价的葡萄糖合成γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌,将来自于植物乳杆菌γ-氨基丁酸合成途径的关键酶谷氨酸脱羧酶基因(lpgad)在产谷氨酸菌株钝齿棒杆菌中进行整合表达,实现葡萄糖到GABA的一步法生产.[方法]运用PCR技术扩增得到带有tac启动子的谷氨酸脱羧酶基因tacgad.通过重叠PCR的方法获得钝齿棒杆菌精氨酸合成途径关键酶N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)基因内部缺失型基因△argB.利用自杀载体pK18mobsacB构建同源整合载体pK18-△argB::tacgad,以△argB的上下游序列为同源臂,通过两次同源重组将tacgad基因整合到钝齿棒杆菌基因组,同时将NAGK基因argB灭活,利用蔗糖致死基因sacB反向筛选标记筛选得到谷氨酸脱羧酶的重组钝齿棒杆菌C.crenatum △argB::tacgad.重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物进行发酵,测定GABA含量.[结果]重组菌C.crenatum △argB::tacgad成功表达谷氨酸脱羧酶,同时阻断了精氨酸合成途径对谷氨酸到GABA代谢途径的竞争,粗酶液基本检测不到NAGK活性,发酵液无精氨酸合成.通过96 h发酵,重组菌可积累约8.28 g/L的GABA.[结论]本研究通过将谷氨酸脱羧酶基因定向整合到钝齿棒杆菌精氨酸合成途径的关键酶基因argB内部,成功表达谷氨酸脱羧酶的同时阻断竞争途径精氨酸的合成.本研究为实现直接利用葡萄糖合成GABA的一步法生产奠定了基础.