龙葵抗阿特拉津生物型叶绿体基因文库的建立

用对阿特拉津(Atrazine)除草剂抗性的龙葵生物型B_(12)株系作材料,制备叶绿体DNA。B_(12)株ctDNA(叶绿体DNA)经BamHI酶解,在0.7％琼脂糖凝胶电泳上呈现24条带,其中最大的片段为18.6kb,最小的片段为1kb。用pBR322作为载体,构建B_(12)株ctDNA BamHI片段文库。通过与探针的分子杂交,从中筛选出含有编码叶绿体32kd蛋白质的阿特拉津抗性基因的克隆pSB135和含有ATP合酶α亚单位基因的克隆pSB132。     

西瓜食酸菌Ⅲ型分泌效应物基因aopW功能初步分析

【背景】细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB)是葫芦科植物上一种严重的检疫性病害,其病原菌为西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)。目前已知Ⅲ型分泌效应物(typeⅢsecreted effectors,T3SEs)是该病菌的关键致病因子,但对其效应物功能和作用机制的认识非常有限。【目的】鉴定西瓜食酸菌Ⅲ型分泌效应物基因aopW,分析其编码蛋白质影响植物免疫的方式,为更深入地认识该基因在西瓜食酸菌致病机制中的作用奠定基础。【方法】利用生物信息学分析其序列特征;借助荧光定量PCR技术分析aopW的表达调控及其与抗病相关基因表达间的关系;利用基因突变及基因功能互补手段,通过分析致病性、寄主活性氧积累量等解析基因功能;采用瞬时表达技术了解AopW诱导非寄主hypersensitive response (HR)能力及其亚细胞定位情况。【结果】aopW基因启动子区存在Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)核心基因结合位点,其编码的蛋白不存在信号肽和跨膜螺旋区,与Ⅲ型分泌效应物harpin蛋白同源;T3SS核心基因hr...     

西瓜食酸菌Ⅲ型效应蛋白AopAI的鉴定及其功能初步分析

【背景】西瓜食酸菌（Acidovorax citrulli,Ac）引起的细菌性果斑病是葫芦科植物重要的病害之一,通过Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secreted system,T3SS）分泌至植物体内的Ⅲ型效应蛋白（type Ⅲ effector,T3E）是该菌重要的致病因子,目前对Ac T3E的认识仍然非常有限。【目的】鉴定西瓜食酸菌候选的T3E Acidovorax outer protein AI （AopAI）,分析其对Ac致病力的影响和干扰植物免疫的方式。【方法】利用生物信息学方法分析AopAI序列特征、AvrBs1无毒报告系统验证蛋白转运功能;通过荧光定量PCR技术分析aopAI基因表达的调控及其对植物病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern,PAMP）激发的免疫反应（PAMP-triggered immunity,PTI）信号通路标记基因表达的影响;利用基因插入突变和基因功能互补方法,检测菌的致病力、植物组织过氧化氢和胼胝质积累量的变化;运用瞬时表达技术分析AopAI亚细胞定位和其抑制激发子诱导细胞死亡的能力。【结果】AopAI蛋白序列中不含跨膜螺旋区和信号肽,含有二磷酸腺苷（adenosine diphosphate,ADP）核糖基转移酶保守结构域;在T3SS核心基因hrpG和hrpX突变体中aopAI基因表达量显著降低;表达AopAI及AvrBs1功能区（59-445 aa）的avrBs1突变体可诱导ECW-10R辣椒叶发生过敏性坏死反应,表明AopAI具有转运功能;aopAI基因突变体在黄瓜子叶上的致病力减弱,但与其互作的黄瓜子叶组织中过氧化氢和胼胝质的含量均显著增加;AopAI在本氏烟叶瞬时表达后,显示其定位于细胞膜和细胞核,还表现抑制激发子NIP诱导的叶细胞死亡,导致叶细胞的PTI信号通路标记基因GRAS2和ACRE31的表达量显著降低。【结论】在西瓜食酸菌中具有一个定位于细胞核和细胞膜、有ADP核糖基转移酶结构域的T3E蛋白AopAI,该T3E是能够抑制NIP诱导的细胞死亡的毒性蛋白,通过抑制ACRE31调节的免疫途径降低植物过氧化氢和胼胝质的积累,以抑制植物PTI防御反应机制。     

龙葵叶绿体的阿特拉津抗性基因psbA的核苷酸序列及有关分析

对克隆在psb135质粒上的来自龙葵阿特拉津抗性生物型的psbA基因进行DNA序列分析,测得长为1384个核苷酸的全序列,包括该基因的全部编码区和5′上游顺序。该基因的核苷酸序列与另一个独立来源的龙葵阿特拉津抗性基因的核苷酸序列完全相同,在由核苷酸推导的氨基酸序列的基础上,比较了分别由龙葵抗阿特拉津和对阿特拉津敏感的psbA基因编码的32kD蛋白质的二级结构,并对其可能的含意进行了讨论。     

龙葵叶绿体ATP合酶α-亚单位基因的克隆

本研究以菠菜叶绿体DNA 2.45kb的SalI片段(含有ATP合酶α-亚单位基因)为探针,从龙英叶绿体DNA BamHI片段文库中筛选出含龙葵叶绿体atpA基因的克隆。通过Southrcn吸印与探针杂交,证明了重组质粒pSB 132的插入片段含有atpA基因。同时将atpA基因定位在龙葵叶绿体DNA SalI、BglI、XhoI和BamHI 4种酶切图谱的限制性片段上。     

在大肠杆菌中具有启动功能的菠菜叶绿体DNA片段的克隆及序列分析

将经sau3A部分酶切过的菠菜叶绿体DNA(ct DNA),克隆到载体pGA46的BgⅢ位点,得到了具有启动功能的菠菜ct DNA片段,对其中的两个片段进行序列分析后观祭到有与原核生物启动区域相符的保守顺序。由此,本文对片段所具有的启动功能的强弱做了说明。     

西瓜食酸菌抗铜基因cueR的生物信息学分析及功能验证

【背景】CueR被证实在模式细菌大肠杆菌的Cue抗铜系统中参与转录调控,西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)中是否有类似的机制尚不清楚。【目的】鉴定西瓜食酸菌中的cueR基因、分析其编码蛋白的特点与功能,可以为进一步探究类Cue系统在西瓜食酸菌铜稳态中的作用机制奠定基础。【方法】以大肠杆菌等4个模式细菌中已经鉴定的CueR为参照,运用生物信息学手段对西瓜食酸菌的CueR (AcCueR)与大肠杆菌的EcCueR、铜绿假单胞菌的PaCueR、沙门氏菌的SeCueR、霍乱弧菌的VcCueR蛋白进行结构、性质、亚细胞定位、互作因子等特征分析;利用同源重组插入突变技术构建西瓜食酸菌FC440菌株cueR基因的突变体,并制备突变体基因功能互补菌株,比较分析各菌株抗铜性表型。【结果】西瓜食酸菌和铜绿假单胞菌的CueR序列相似性最高;5个细菌的CueR蛋白均属于HTH-MerR-SF超家族,三级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成;5种蛋白结构相似;AcCueR可以与西瓜食酸菌中P型ATP酶(即CopA)、多铜氧化酶CueO产生互作,且copA启动子中存在一个与CueR结合的回文结构。在含Cu~(2+)培养基上,突变菌株FC440(?cueR)生长能力明显减弱,基因功能互补菌株FC440(?cueR-cueR)的生长能力则完全恢复。【结论】西瓜食酸菌中的cueR基因与菌的抗铜性相关,其AcCueR蛋白与大肠杆菌等菌中的CueR具有相似的结构与功能,在西瓜食酸菌中可能存在类似于大肠杆菌的Cue抗铜系统。     

西瓜食酸菌Ⅲ型效应蛋白AopBF1的鉴定与功能分析

【背景】细菌性果斑病（bacterial fruit blotch,BFB）是一种发生在葫芦科作物上的检疫性病害,其病原菌为西瓜食酸菌（Acidovorax citrulli）,西瓜食酸菌通过Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system,T3SS）将重要的致病因子Ⅲ型效应蛋白（type Ⅲ effector,T3E）转运到植物体内,从而致病。目前,对于T3E致病机制的认识非常有限。课题组前期已鉴定到西瓜食酸菌FC440菌株中的一些候选T3E。【目的】明确西瓜食酸菌FC440菌株候选T3E中AopBF1的序列特征、转运特性及其在病原菌致病过程中的作用,可以为深入解析病原菌致病机制奠定理论基础。【方法】利用生物信息学手段,预测分析AopBF1的T3E序列特征;通过RT-qPCR、无毒蛋白报告系统检测AopBF1所受调控及其转运特性;观察aopBF1突变体（插入突变）及过表达时西瓜食酸菌的致病力表型,分析AopBF1对西瓜食酸菌致病性的贡献。【结果】AopBF1具有T3E的序列特征、不含保守结构域,具有蛋白激酶序列特征;AopBF1在T3SS核心调控基因hrpX、hrpG突变株中的表达量显著降低;当aopBF1基因与AvrBs1功能区（59-445 aa）片段同时于avrBs1突变株中表达时,能够诱发含Bs1蛋白的ECW-10R辣椒叶片发生过敏性坏死反应;aopBF1突变株对寄主黄瓜的致病力显著减弱,而同时黄瓜组织中过氧化氢、超氧阴离子自由基及胼胝质的积累量表现为显著增加;AopBF1过表达菌株对寄主的致病力显著增强,其在诱导本氏烟的hypersensitive response （HR）反应发生上表现延迟;AopBF1瞬时表达时,显示定位于本氏烟细胞的细胞质、细胞核和细胞膜,可诱发本氏烟发生HR反应,促进PAMP-triggered immunity （PTI）及激素通路相关基因的表达。【结论】AopBF1是西瓜食酸菌的一个具有蛋白激酶特征的T3E,抑制寄主活性氧和胼胝质积累等PTI免疫反应以促进西瓜食酸菌的致病,激发含R抗性蛋白的本氏烟的PTI和激素相关抗病免疫反应。