Apelin-13对LPS诱导人脐静脉内皮细胞屏障损伤的干预作用*

目的: 探讨Apelin-13对LPS诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)屏障损伤的影响。方法: 将体外培养的HUVECs分为4组:正常对照组、LPS组、Apelin-13+LPS组、Apelin-13组。用5 μg/ml LPS作用细胞24 h, 复制屏障功能受损模型。1 μmol/L Apelin-13提前30 min给予,再给予LPS作用24 h,确定Apelin-13的影响。通过CCK8法检测Apelin-13对细胞活力的影响;Western blot检测血管内皮细胞钙粘蛋白(VE-cadherin)、纤维状肌动蛋白(F-actin)表达变化;免疫荧光检测VE-cadherin、F-actin的表达变化及核转录因子Kappa B(NF-κB p65)入核情况。结果: 与正常对照组相比,单独给予Apelin-13对细胞活力无明显影响。与正常对照组相比,LPS组细胞活力明显下降(P＜0.01),VE-cadherin蛋白表达下降(P＜0.01)、F-actin蛋白表达升高(P＜0.05),NF-κB p65入核明显增加。与LPS组相比,Apelin-13明显增加细胞活力(P＜0.01),VE-cadherin蛋白表达增加(P＜0.05)、F-actin蛋白表达下降(P＜0.01),蛋白NF-κB p65入核下降明显。结论: Apelin-13可减轻LPS诱导的人脐静脉内皮细胞损伤及屏障受损,其机制可能与抑制炎症相关。     

结直肠息肉切除术患者肠道微生态失调分析及其与癌变进展的相关性

目的分析结直肠息肉切除术患者肠道微生态失调情况及其与癌变进展的相关性。方法前瞻性选择2015年7月至2016年7月在我院行结直肠息肉切除术的89例患者为研究对象,评价所有研究对象手术前后肠道菌群计数、肠道菌群失调情况,采用单因素和多因素Logistic回归分析结直肠息肉切除术患者癌变的影响因素。结果结直肠息肉患者术后大肠埃希菌计数(10.85±0.50)、粪肠球菌计数(10.12±0.55)显著高于术前(8.34±0.41,7.76±0.37)(均P0.01),结直肠息肉患者术后双歧杆菌计数(2.56±0.68)、乳杆菌计数(2.83±0.71)显著低于术前(5.20±1.06,5.93±0.88)(均P0.01)。结直肠息肉患者术后Ⅰ度菌群失调比例(23.60%)显著低于术前(55.06%)(P0.05),结直肠息肉患者术后Ⅱ、Ⅲ度菌群失调比例(50.56%,25.84%)显著高于术前(34.83%,10.11%)(均P0.05)。随访3年显示89例结直肠息肉切除术患者癌变率为33.71%,性别、病理类型不同的结直肠息肉切除术患者癌变率差异无统计学意义(均P0.05),年龄、遗传史、息肉直径、肠道菌群失调程度不同的结直肠息肉切除术患者癌变率差异具有统计学意义(均P0.05)。年龄、遗传史、肠道菌群失调程度是结直肠息肉切除术患者癌变的影响因素(均P0.05)。结论结直肠息肉切除术患者存在明显肠道微生态失调情况,肠道微生态失调是结直肠息肉切除术患者癌变的危险因素,这对临床防治结直肠息肉切除术患者癌变有重要指导意义。     

糖尿病患者肠道菌群特征及其相关性的系统评价

目的对糖尿病患者肠道菌群特征及其相关性进行系统评价。方法检索知网、维普、万方、PubMed、Cochrane library、Embase等数据库关于糖尿病患者肠道菌群特征及其相关性的文献,同时追踪纳入文献的参考文献,时限为2009年3月至2019年3月,采用统一提取表,由两名研究者独立按照规定的纳入排除标准进行文献提取和方法学质量评估。最后采用RevMan 5.3软件进行Meta合并,Stata 12.0软件进行亚组分析与发表性偏倚识别。结果共纳入25篇研究,合计2 209例患者。Meta分析显示:(1)糖尿病患者菌群总量(SMD=-0.30,P=0.53)、乳杆菌数量(SMD=-0.79,P=0.20)下降,拟杆菌数量(SMD=1.43,P=0.12)、梭菌数量(SMD=0.28,P=0.40)增加,差异均无统计学意义,双歧杆菌数量(SMD=-1.82,P=0.02)下降,差异有统计学意义。(2)糖尿病患者菌群Shannon指数I~2=91%,r=-0.21[-0.32,0.09],P0.05;Chao1指数I~2=0%,r=-28.17[-40.85,-15.48],P0.05;均下降。(3)拟杆菌、双歧杆菌、梭菌与空腹血糖的相关性分别为:I~2=0%,r=-0.15[-0.27,-0.03];I~2=0%,r=-1.16[-1.42,0.91];I~2=0%,r=-0.28[-0.42,-0.14],均P0.05。而乳杆菌的相关性差异无统计学意义:I~2=47%,r=-0.00[-0.30,0.29],P=0.98。(4)乳杆菌和拟杆菌与炎症因子(TNF-α、IL-6)呈负相关,乳杆菌(r=-0.43;r=-0.60),P0.05;拟杆菌(r=-0.58;r=-0.58),P0.05,差异有统计学意义。结论糖尿病患者肠道菌群总量无明显变化,但有益菌含量和多样性下降,拟杆菌、双歧杆菌和梭菌含量与血糖水平呈负相关,而乳杆菌无相关,其结果还需要大样本、高质量的研究加以论证。     

G试验联合真菌培养在假丝酵母菌血流感染诊治中的价值

目的了解假丝酵母菌血流感染患者常见病原菌分布及药物敏感性情况,评估(1,3)-β-D-葡聚糖检测(G试验)联合真菌培养在假丝酵母菌血流感染诊治中的应用价值。方法回顾性分析浙江省人民医院2014年1月至2018年12月假丝酵母菌血流感染患者的病原菌分布及药物敏感状况,同步分析G试验检测结果。结果假丝酵母菌血流感染病原菌以白假丝酵母菌为主。所检出的90株假丝酵母菌对两性霉素B最为敏感,敏感率为100.00%;对5-氟胞嘧啶、伏立康唑、氟康唑和伊曲康唑的敏感率分别为98.89%、90.00%、87.78%和77.78%。热带假丝酵母菌对伏立康唑、氟康唑和伊曲康唑的敏感率分别为56.25%、50.00%和43.75%,光滑假丝酵母菌对伊曲康唑敏感率仅为58.33%。假丝酵母菌血流感染患者、局部假丝酵母菌感染患者血清(1,3)-β-D-葡聚糖水平高于对照组,差异有统计学意义(t=6.576、P0.001;t=1.988、P=0.049)。假丝酵母菌血流感染患者血清(1,3)-β-D-葡聚糖水平高于局部假丝酵母菌感染患者,差异有统计学意义(t=4.738,P0.001)。90例患者中有54例进行了G试验,其中13例患者G试验先于血培养出现阳性结果。G试验阴性患者(54例中有17例G试验为阴性)中有8例第1次送检G试验晚于血培养报阳时间。结论 G试验可作为假丝酵母菌血流感染的诊断参考依据,血清(1,3)-β-D-葡聚糖水平与假丝酵母菌感染的严重程度有关。G试验联合真菌培养在假丝酵母菌血流感染诊治中具有重要作用,有助于临床早期诊断和监测治疗。     

利用光合细菌进行微生物修复：一种降低辛硫磷在养殖水中积累的低成本方法

[背景] 中国是农业生产大国,渔林农牧占比庞大。有机农药无论在畜牧业还是水产养殖业都有广泛的应用。有机磷农药（Organophosphorus Pesticide,OP）是应用最广泛的有机农药,具有低毒和不易残留的优点。OP在水体中大量积累可通过生物富集作用间接影响人体健康,由此产生的生殖毒性不容忽视。光合细菌作为环境友好型水体有益菌,部分菌种具有降解有机农药的功能。[目的] 自上海海洋大学明湖中分离纯化得到一株光合细菌（编号SPZ）。探究其对辛硫磷的耐受程度及降解效果,为养殖水体中有机磷农药的生物降解提供目的菌株。[方法] 利用16S rRNA基因序列分析方法对目标菌株进行种属鉴定;利用紫外分光光度法测定分离菌株SPZ和标准菌株ST在不同接种量下的OD₆₆₀并测定实验周期内光合细菌在不同浓度辛硫磷中OD₆₆₀的变化趋势,以示辛硫磷对光合细菌的毒性作用;利用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）测定菌株对水体辛硫磷的降解能力;通过HPLC测定加热致死菌与活菌对水体辛硫磷的降解能力,确定菌株对辛硫磷的降解方式。[结果] 16S rRNA基因序列分析表明菌株SPZ与红假单胞菌属相似度高达99%以上,与沼泽红假单胞菌ATCC 17001菌株聚为一支,置信度为100%;菌株SPZ与菌株ST的适宜接种量为10%;菌株SPZ可耐受100 mg/L的辛硫磷,当浓度超过该值后,辛硫磷对光合细菌生长产生显著的抑制作用;当光合细菌进入生长稳定期后添加辛硫磷,1 d时可相对降解辛硫磷（12.97%-26.69%,20.0 mg/L;24.25%-32.85%,2.0 mg/L;16.66%-34.59%,0.2 mg/L）,3 d时可相对降解辛硫磷（46.63%-53.95%,20.0 mg/L;24.78%-30.34%,2.0 mg/L;31.92%-39.25%,0.2 mg/L）,5 d时可相对降解辛硫磷（93.65%-97.72%,20.0 mg/L;67.69%-74.41%,2.0 mg/L;10.34%-24.27%,0.2 mg/L）。[结论] 菌株SPZ作为一种常见光合细菌,能够有效去除水体中的辛硫磷农药,具有生物修复功能,在水产养殖和有机磷农药污染水处理中有广阔的前景。     

牛磺酸上调基因1(TUG1)对肝纤维化的作用及其机制*

目的:探讨牛磺酸上调基因1(TUG1)在肝纤维化中的作用机制。方法:按照文献建立TGF-β1(5 ng/ml)刺激的活化肝星状细胞模型和经典的1%DMN(1 ml/kg/d)致大鼠肝纤维化模型,将肝纤维化大鼠和活化肝星状细胞(HSC)均分为模型对照组、阴性对照组(沉默TUG1阴性对照)、siRNA干扰组(TUG1基因沉默组)。实验结束后利用苏木精-伊红(HE)染色检测大鼠肝脏组织病理变化;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、蛋白免疫印记(Western blot)分别测定大鼠肝组织及活化肝星状细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TUG1、I型胶原蛋白(collagenI)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)、Smad2、Smad3表达水平。结果:肝组织病理学检查显示,沉默TUG1能够明显缓解肝脏纤维化病理改变,Western blot结果显示,沉默TUG1能够显著降低大鼠肝组织和活化肝星状细胞中TUG1、α-SMA、collagenI、MMP-2、TIMP-1、Smad2、Smad3基因与蛋白表达水平(P＜0.05)。与模型对照组相比,阴性对照组的TUG1、α-SMA的蛋白与基因水平明显升高(P＜0.05)。与模型对照组和阴性对照组相比,siRNA干扰组中TUG1, α-SMA, collagenI, MMP-2, TIMP-1, Smad2 and Smad3的蛋白和基因水平显著降低(P＜0.05),而在模型对照组和阴性对照组中TUG1, α-SMA, collagenI, MMP-2, TIMP-1, Smad2 and Smad3的蛋白和基因表达水平之间差异无显著性。结论:TUG1在肝纤维化组织和活化的肝星状细胞中显著上调,沉默TUG1可能通过抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路改善1%DMN致大鼠肝纤维化病理损伤,降低活化肝星状细胞中纤维化相关蛋白水平,发挥抗肝纤维化的作用。     

草鱼呼肠孤病毒NS31蛋白在昆虫细胞中表达及互作多肽筛选

草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus,GCRV)是引发病毒性草鱼出血病的主要病原.前期研究证实GCRV-S7基因片段编码NS31蛋白是GCRV的非结构蛋白,在病毒感染的中后期表达.为深入开展NS31的具体生物学功能,本研究从GCRV-JX01株病毒基因组中扩增NS31,克隆至pFastBacHTA载体;利用杆状病毒Bac-to-Bac系统成功表达携带his标签的重组蛋白his-NS31;Western-Blot和IFA实验表明重组杆状病毒能够感染昆虫细胞(Sf9)表达NS31,进一步通过his-Ni2+柱纯化NS31,SDS-PAGE鉴定蛋白约为30KD.运用噬菌体展示技术筛选噬菌体12肽库,研究NS31特异性结合多肽.挑取30个克隆进行DNA序列测定,结果表明NS31主要和2种多肽分子相互作用.进一步结合生物信息学分析表明上述多肽与草鱼基因组中6个基因具有同源性,提示其可能是NS31互作蛋白.本研究为深入探索NS31在病毒感染过程中的生物学功能奠定了重要基础.     

呼吸道合胞病毒IgM抗体AlphaLISA快速检测方法的建立

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)属于副粘液病毒科,是一种下呼吸道感染最主要的RNA病毒.呼吸道合胞病毒感染是引起全球婴幼儿高致死率的呼吸道感染病原,仅次于疟疾,但用于检测RSV感染的选择相对较少.本文通过抗原抗体结合原理,建立呼吸道合胞病毒(RSV)IgM抗体AlphaLISA快速检测方法.小鼠抗人IgM单克隆抗体偶联的受体微球与临床血清样品中RSV特异性IgM抗体结合,RSV特异性IgM抗体再与生物素标记的RSV抗原结合,生物素连接偶联链霉亲和素的供体微球;受体微球和供体微球的距离被拉近小于200nm,680nm荧光激发供体微球生成单线态氧,扩散给受体微球,发射波长为520～620nm的荧光,荧光强度与血清中RSV特异性IgM抗体呈正比.结果显示,该方法批内变异系数与批间变异系数均小于10％,不与其他呼吸道病原体发生交叉反应,与间接免疫荧光法具有较好的一致性,总符合率达83.33％.该方法具有微量检测、快速省时、操作简便等优势,可快速检测RSV的IgM抗体,为早期确诊RSV感染提供高效可行方案.     

酵母PMT1和TED1基因在细胞壁应激反应中的作用

实验室前期研究表明,蛋白质O-甘露糖转移酶1 (Protein O-mannosyltransferase 1,Pmt1p) 和Ted1p（Traffcking of Emp24p/Erv25p-dependent cargo disrupted）在细胞寿命和内质网应激反应方面存在相互调控关系。进一步研究酵母Pmt1p和Ted1p在细胞壁应激反应中（诱导剂为荧光增白剂或刚果红）的作用。观察PMT1基因缺失（pmt1Δ）酵母菌株和TED1基因缺失（ted1Δ）酵母菌株,以及PMT1和TED1双基因缺失（pmt1Δ ted1Δ）酵母菌株在细胞壁应激反应条件下的克隆形成能力和细胞分裂增殖活性;qRT-PCR检测细胞壁应激反应通路中Slt2p、Ssd1p和Mpt5p等效应蛋白的转录水平。结果表明,在细胞壁应激反应条件下,与对照菌株的生长状态比较,pmt1Δ菌株生长缓慢,ted1Δ菌株生长较快;进一步缺失PMT1基因使得ted1Δ菌株生长缓慢。与对照菌株中效应蛋白的转录水平比较,pmt1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株中SLT2、SSD1和MPT5基因的转录水平明显上调,ted1Δ菌株中的无明显变化;与pmt1Δ菌株比较,pmt1Δted1Δ菌株中SLT2和MPT5表达明显下调,SSD1表达无明显变化。缺失TED1基因增强酵母细胞对细胞壁应激反应的抵抗性;进一步缺失PMT1基因增强ted1Δ菌株对应激反应的敏感性,上调细胞壁应激反应通路中效应蛋白的转录表达水平。     

人p53启动子萤光素酶报告基因的构建及其活性测定

目的：克隆p53基因的启动子,插入萤光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增人p53启动子,插入萤光素酶报告基因载体pGL4．0-empty,将重组质粒转染293T、ZR75-1、HepG2、A549细胞,测定p53启动子的转录活性。结果：构建了p53启动子的萤光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的p53启动子正确;活性实验表明,报告基因在多种细胞中显示构建的p53启动子活性,并呈现一定的剂量效应;转录因子USF能以剂量效应方式提高p53报告基因的转录活性。结论：克隆了人p53启动子,为进一步研究调控p53的转录因子奠定了基础。