油橄榄类黄酮生物合成相关酶的研究进展

类黄酮是酚类代谢物的一大亚组,其生物合成属于苯丙素代谢途径的分支,它们广泛分布在整个植物界。不仅在植物中有极其重要的生理、生化和生态功能,而且对动物的生物活性及提供营养等方面做出重要贡献。油橄榄叶、果实、根都富含类黄酮,具有重要研究价值。本研究综述了油橄榄类黄酮生物合成途径相关酶(CHI,CHS,F3H,DFR,FLS,FNSI,LAR,F3'H,F3',5'H)的底物特异性和功能性区域,分析总结了编码这些酶的基因在不同物种间的序列相似性和在不同组织的表达特异性。这对深入研究植物类黄酮生物合成相关酶的结构和功能,基因的克隆、表达和调控以及对油橄榄类黄酮生物合成途径相关酶的研究具有参考价值。     

粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶的分离纯化及酶学性质研究

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育所得的漆酶高产菌株,Active-PAGE分析表明SAH-12在高氮低碳无机盐培养液（LM3）中至少分泌3种漆酶同工酶（Lac1、Lac2、Lac3）。采用硫酸铵盐析、透析和Sephadex-G75分子筛层析从其培养液中分离纯化得到电泳纯的Lac1,纯化倍数6.54,酶活性回收59.7%。Lac1经SDS-PAGE验证为一条带,其表观分子量为61.5kDa。Lac1为一种糖蛋白,含糖量11.6%,等电点pI4.40,催化氧化底物ABTS的最适反应温度为60℃,最适pH为2.6,Km值为25μmol/L。Lac1在40℃（pH4.0）以下和pH1.5～5.0（28℃）范围内稳定。金属离子Fe2＋、Ag＋、Hg2＋和Cr3＋与抑制剂DTT、SDS、EDTA和DMSO对Lac1有抑制作用,其中Fe2＋和DTT完全抑制酶活,而Cu2＋对酶有明显激活作用,Mn2＋、Zn2＋对酶活影响不大。Lac1不仅可使一些合成染料明显脱色,而且对苹果汁多酚祛除也有较好效果。40℃用该酶（1U/mL）处理苹果汁5h,其多酚含量可降低40%。     

粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶的分离纯化及酶学性质研究

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育所得的漆酶高产菌株,Active-PAGE分析表明SAH-12在高氮低碳无机盐培养液(LM3)中至少分泌3种漆酶同工酶(Lac1、Lac2、Lac3)。采用硫酸铵盐析、透析和Sephadex-G75分子筛层析从其培养液中分离纯化得到电泳纯的Lac1,纯化倍数6.54,酶活性回收59.7%。Lac1经SDS-PAGE验证为一条带,其表观分子量为61.5kDa。Lac1为一种糖蛋白,含糖量11.6%,等电点pI4.40,催化氧化底物ABTS的最适反应温度为60℃,最适pH为2.6,Km值为25μmol/L。Lac1在40℃(pH4.0)以下和pH1.5～5.0(28℃)范围内稳定。金属离子Fe2+、Ag+、Hg2+和Cr3+与抑制剂DTT、SDS、EDTA和DMSO对Lac1有抑制作用,其中Fe2+和DTT完全抑制酶活,而Cu2+对酶有明显激活作用,Mn2+、Zn2+对酶活影响不大。Lac1不仅可使一些合成染料明显脱色,而且对苹果汁多酚祛除也有较好效果。40℃用该酶(1U/mL)处理苹果汁5h,其多酚含量可降低40%。     

粗毛栓菌和蜡状芽孢杆菌及其共固定菌对pb2+的吸附

将粗毛栓菌菌丝球与蜡状芽孢杆菌共固定为共固定菌.以粗毛栓菌菌丝球、蜡状芽孢杆菌和共固定菌为研究对象,测定不同吸附时间、初始pH、吸附剂浓度和pb2+浓度对3种生物吸附剂吸附pb2+的影响,并将3种生物吸附剂吸附pb2+前后的红外吸收光谱进行分析比较.结果表明:在吸附剂浓度为2g.L-1、pH为5.0、pb2+浓度为50 mg·L-1条件下对pb2+吸附lh效果良好,其吸附率分别为71.7％、91.0％和96.9％.生物吸附剂红外光谱主要由蛋白质、碳水化合物和含硫、磷酸基团的吸收带组成,表明对pb2+吸附起主要作用的官能团是羟基、羧基、磷酸基和含硫基团.     

禾本红酵母Y－5对结晶紫、孔雀石绿的吸附

研究了培养时间、初始pH、温度对禾本红酵母Y-5吸附结晶紫、孔雀石绿的影响,并对吸附剂的解吸和循环利用等进行考察.结果表明： 在染料浓度为50 mg·L^-1、pH 7.0、摇床转速150 r·min^-1、30 ℃、吸附10 h时,红酵母对结晶紫、孔雀石绿的吸附率分别达峰值,为93.8%和87.7%;解吸后的菌体对结晶紫、孔雀石绿的吸附率分别为85.5%和78.5%,说明菌体对染料的吸附是可逆的,循环利用效果良好,菌体可再生和循环利用;禾本红酵母Y-5对结晶紫、孔雀石绿的脱色机理为吸附作用,染料多被吸附在红酵母表面的羟基（-OH）上,其吸附染料快速、高效、可逆,在染料废水处理上具有潜在的应用价值.     

油橄榄HMGR基因家族的克隆表达及功能验证

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR),催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-Co A)生成甲羟戊酸(MVA),是MVA途径中第一个关键酶。油橄榄是一种重要的经济油料作物,其含有的萜类物质具有重要营养价值,但关于调控萜类物质代谢途径的关键基因研究较少。为研究萜类合成途径关键酶基因HMGR,本研究采用RT-PCR法克隆油橄榄HMGR基因,进行生物信息学分析及构建原核表达载体,对表达蛋白生物活性进行功能验证,并采用荧光定量PCR分析HMGR在油橄榄不同生长阶段的表达量。结果表明:克隆出油橄榄HMGR基因家族的三个基因,分别命名为Oe HMGR1、Oe HMGR2、Oe HMGR3,m RNA ORF的长度分别为1 713 bp、1 773 bp、1 737 bp,编码570、590、578个氨基酸;基因编码蛋白均有2个跨膜区及HMGR催化活性的结构域,不含信号肽;构建了原核表达载体p ET30b(+)-Oe HMGR,转入到大肠杆菌BL21中成功表达,3个重组酶蛋白分子量大小均在66.2~68.0 k D之间,分离纯化重组蛋白进行功能验证,GC-MS检测表明该蛋白具有HMGR催化活性功能;荧光定量PCR分析表明该家族基因在果实和叶片中表达量较高,而在根、茎、花中表达量较低,在开花后45 d、90 d、120 d表达量较低,但在花后165 d表达量上升至较高水平。该研究为进一步鉴定Oe HMGR的功能及油橄榄萜类物质的合成生物学研究奠定基础。     

禽类饲用芽孢杆菌的筛选及固体发酵条件优化

筛选得到3株适用作为禽类饲料添加剂的枯草芽孢杆菌,分别命名为B395、B605和BM1。该3株菌株均能够在42℃正常生长,能抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,且能耐受0.3%胆盐,能产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶。通过饲喂试验,观察到菌剂组可明显促进肉鸡生长,有效降低料肉比。选取B395作为试验菌株,以培养后活菌数为指标,得到其最佳固体发酵条件为麦麸∶稻糠为3∶2、葡萄糖0.5%、尿素2%、KH2PO40.5%,含水量45%、接种量5%、温度37℃、培养时间3d。按上述培养条件,对B395进行培养,摇瓶式发酵可使活菌数可达到(1.3±0.1)×1010CFU/g,浅盘式发酵可使活菌数达到(1.3-1.4)×1010CFU/g;并对B605和BM1进行培养,得到活菌数均超过109CFU/g。     

粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶基因的克隆与序列分析

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育得到的漆酶高产菌株。为了对其漆酶基因进行研究和利用,采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术,从T.gallica诱变菌株SAH-12分离得到漆酶基因全长cDNA Lacc1(GenBank accession No.DQ431716)及其对应的结构基因Lac1(DQ431715)。该基因属于真菌漆酶基因家族,与来自出发菌T.gallica漆酶基因lacA(AY875867)在成熟肽编码区的同源性最高(一致性为98%)。Lacc1全长1891bp,由40bp的5'-UTR、1554bp的完整ORF和297bp的3'-UTR构成,具有polyA加尾信号AATACA和59bp的polyA结构;其完整ORF可编码21个氨基酸残基组成的信号肽和496个氨基酸残基组成的成熟蛋白。在Lacc1基因的推导氨基酸序列中有4个潜在的N-糖基化位点和4个参与二硫键形成的Cys残基,且含有真菌漆酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型铜离子结合区的4个高度保守序列。结构基因Lac1全长2338bp,含10个内含子和11个外显子,各内含子长度在51bp~76bp之间,且其序列均符合5'-gt…ag-3'规则。     

四川小麦地方品种AS1643中低分子量谷蛋白基因的克隆及其蛋白质的二级结构预测

根据小麦低分子量谷蛋白基因保守区序列设计引物P1/P2, 采用PCR法对四川小麦地方品种AS1643的基因组DNA进行扩增, 获得1条约900 bp的片段, 分离、纯化后连接到载体pMD18-T上, 对筛选阳性克隆测序, 获得1个低分子量谷蛋白基因LMW-AS1643(GenBank登录号: EF190322), 其编码区长度为909 bp, 可编码302个氨基酸残基组成的成熟蛋白。序列分析结果表明, LMW-AS1643具有典型的低分子量谷蛋白基因的基本结构, 其推导氨基酸序列与其它已知的LMW-GS相比, 最高相似性为93.40%。生物信息学分析表明, 在LMW-AS1643低分子量谷蛋白中, 无规则卷曲含量最高, 为67.90 %, 其次是a-螺旋, 占30.46 %, b-折叠含量最少, 为1.64 %。     

粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶基因的克隆与序列分析

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育得到的漆酶高产菌株。为了对其漆酶基因进行研究和利用,采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术,从T.gallica诱变菌株SAH-12分离得到漆酶基因全长cDNA Lacc1(GenBank accession No.DQ431716)及其对应的结构基因Lac1(DQ431715)。该基因属于真菌漆酶基因家族,与来自出发菌T.gallica漆酶基因lacA(AY875867)在成熟肽编码区的同源性最高(一致性为98%)。Lacc1全长1891bp,由40bp的5'-UTR、1554bp的完整ORF和297bp的3'-UTR构成,具有polyA加尾信号AATACA和59bp的polyA结构;其完整ORF可编码21个氨基酸残基组成的信号肽和496个氨基酸残基组成的成熟蛋白。在Lacc1基因的推导氨基酸序列中有4个潜在的N-糖基化位点和4个参与二硫键形成的Cys残基,且含有真菌漆酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型铜离子结合区的4个高度保守序列。结构基因Lac1全长2338bp,含10个内含子和11个外显子,各内含子长度在51bp~76bp之间,且其序列均符合5'-gt…ag-3'规则。