基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化、纯化和检测方法

目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共转染人胚肾293T细胞,12 h后观察Avi-tag标签对eGFP蛋白在细胞内定位的影响;48 h后裂解细胞,用链霉亲和素珠子纯化生物素标记的eGFP,SDS-PAGE观察eGFP纯化和富集情况,并优化基于Western印迹的生物素化eGFP检测方法。结果:Avi-tag标签对eGFP在细胞内的定位无影响,同时BirA酶在293T细胞内可将带Avi-tag标签的eGFP标记上生物素;生物素化的eGFP可特异性地被链霉亲和素珠子纯化和富集,纯度可达95%;Western印迹检测生物素化蛋白的最终条件为5%的BSA作为封闭液和终浓度为100 ng/mL的链霉亲和素-HRP。结论:建立了基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化标记、纯化与检测方法,为该方法的广泛应用奠定了前期技术基础。     

烟草叶片液泡内氨基酸成份研究

液泡是植物细胞中特有的大型细胞器,具有重要的生理功能。本文报导了用双酶直接酶解法从烟草叶肉细胞中分离原生质体和完整液泡。在最适保存条件下,原生质体和液泡分别在３６和１２小时后,尚有一半保持活力。液泡内含有大量游离氨基酸,液泡膜ＡＴＰａｓｅ的最适ｐＨ为７．０,受Ｃｌ－激活,受ＮＯ３－抑制。     

分离纯化后的烟草叶片液泡的显微观察

将分离纯化后的烟草叶片注佻 分别置于光镜和电镜下观察得到原生质体,原生质体释放液泡的过程,纯化后液泡的相应照片,结果说明我们选用的方法能得到完整的原生质体和液泡,且中央液泡是成熟植物细胞中体积最大的细胞器。     

山西和天津卤虫卵的生化组分分析

运用生化实验方法对来自山西运城和天津盐场的卤虫卵进行了组分的比较研究。结果表明,两地卤虫卵的粗脂含量分别为8．46％和8．83％,碘值分别为70．50和74．78,蛋白质含量分别为29．5％和32．3％,均富含18种氨基酸,其中包括8种必需氨基酸,Tm值分别为70．8℃和69．3℃,GC值分别为41．24％和37．58％。结论：两地卤虫卵的生化组分有一定的地区差异。     

重组人乙酰胆碱受体原核表达条件的优化及初步应用

在已建立的重组人乙酰胆碱受体表达质粒的基础上进一步优化试验条件,初步应用于ELISA分析实验性重症肌无力模型(EAMG)中抗体的滴度.取构建好的pET28a(+)-hAChRα1-210经小规模诱导,确定IPTG诱导的最佳浓度为0.006 mmol/L,最佳时间为5 h,最佳温度为37℃;大规模诱导培养后离心,超声得到菌体沉淀,1 mol/L尿素洗涤后8 mol/L尿素溶解,过Ni2+亲和层析柱,紫外吸收及Folin酚法确定表达量较多而蛋白最纯的4℃透析过夜,PEG8000浓缩后免疫雌性近交系Lewis鼠构建EAMG,ELISA检测分析模型大鼠血清中抗体的效价.结果表明,制备了大量较纯的rhAChR,并成功应用于ELISA法分析EAMG模型中抗体的滴度.因此,获得的纯化rhAChR可用于构建EAMG模型及鉴定.