小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型标准化血清制备及ELISA检测方法的建立

目的制备标准化小鼠呼肠孤病毒III型（reovirus 3,Reo-3）免疫血清,建立小鼠Reo-3抗体ELISA检测方法。方法使用动物来源的Reo-3病毒感染BALB/c小鼠,获得高效价免疫血清;以BHK-21细胞制备Reo-3病毒抗原,同时制备做正常对照抗原。滴定抗原和标准化小鼠Reo-3血清的最佳工作浓度,进行特异性、敏感性、重复性、稳定性等实验。结果制备18 mL抗Reo-3血清,经检测,IFA效价达1∶640,IEA效价达1∶160;Reo-3抗原和标准化小鼠Reo-3免疫血清最佳工作浓度分别为5μg/mL和1∶2400;该ELISA检测体系Reo-3特异抗原批内变异系数为3.8%,批间变异系数为4.0%;检测灵敏度〉1∶4400;与仙台病毒（SV）、小鼠肝炎病毒（MHV）、小鼠腺病毒（Mad）、小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）、小鼠多瘤病毒（POLY）均无交叉反应。经37℃破坏性试验,2 d稳定性试验相对偏差〈27%。结论本研究制备的Reo-3抗血清达到同批次大量高滴度的水平,可作为检测实验小鼠Reo-3病原的标准化质控血清。本研究建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。该体系可用于大、小鼠等实验动物Reo-3抗体的检测。     

我国人轮状病毒不同基因型NSP4的致病性研究

对我国轮状病毒流行株NSP4基因变异特点的分析表明,NSP4基因主要可分为Wa组和Kun组,在Wa组内可形成三个亚组,形成了4种NSP4基因型.为了进一步阐明人轮状病毒流行株NSP4基因变异与其致病性变化是否存在联系,我们首先利用杆状病毒载体对NSP4蛋白进行表达,获得了对应4种不同NSP4基因型的重组杆状病毒rvBac97B6,rvBac97S34,rvBac97S36和rvBac97SZ8.用这些病毒感染Sf-9细胞后,检测细胞内Ca2+浓度的变化,发现与野生型杆状病毒感染细胞相比,重组病毒感染细胞内的Ca2+浓度显著升高,但各个重组病毒之间无显著性差异.在此基础上,我们进一步在E.coli中分别表达纯化了代表Wa和Kun基因分组的97S34和97SZ8流行株的NSP4.分别用纯化的重组NSP4蛋白攻击乳鼠后,发现不同基因型的NSP4蛋白的致腹泻活性没有明显差异,这种作用可被NSP4抗体拮抗,但这种拮抗作用存在基因型特异性.上述结果表明人轮状病毒流行株NSP4氨基酸序列间的变异并没有使其钙调节及致腹泻能力产生改变,在致腹泻作用中发挥关键作用(或决定性作用)的氨基酸位点在不同NSP4基因型间可能是相对保守的.针对NSP4抗体的有效性也为新型轮状病毒疫苗和药物研究提供了线索.     

细菌萜类合成酶的生物信息学分析

【目的】目前对于萜类合成酶(Terpenoid synthase,TPS)的研究主要集中在植物和真菌中,而对细菌TPS的系统研究尚少。建立在大量已经被测序的细菌基因组基础上,利用生物信息学方法,对细菌TPS在全基因组范围内进行识别、分类和功能分析。【方法】利用TPS的隐马尔科夫模型(Pfam编号为PF03936)搜索自建的细菌蛋白质组数据库,预测出细菌TPS。对这些候选TPS的蛋白序列用MAFFT 7.130b进行多序列比对,并利用MEGA 6.0对多序列比对结果进行进化分析。利用MEME和PredictProtein分别进行细菌TPS的基序(Motifs)和点突变分析。【结果】建立在生物信息学分析的基础上,1 423条细菌TPS被识别,它们分布在8个门中,即放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)和衣原体门(Chlamydiae)。进化分析表明细菌TPS可分为4大类,Motifs分析表明除了各类之间保守的基序(Motifs)外,还有特异的Motifs,这暗示着细菌TPS在不同类别之间的功能分化。点突变分析表明,细菌TPS不同位点的氨基酸突变对TPS功能的影响不同。【结论】细菌TPS主要分布于8个门中,其中在2个门中细菌TPS尚未见报道,即厚壁菌门(Firmicutes)与酸杆菌门(Acidobacteria)。基于进化分析,可以把细菌TPS分为4类,各类之间的差异可能是由类特异的Motifs决定的,另外细菌TPS不同氨基酸位点的突变分析为今后验证TPS的功能提供了很好的理论基础。     

抗人B淋巴细胞单克隆抗体清除中国恒河猴体内B淋巴细胞效果观察

目的用抗人B淋巴细胞单克隆抗体（利妥昔单抗注射液,Rituximab）通过静脉滴注的方法敲除中国恒河猴体内B淋巴细胞,并观察其敲除效果,为建立B淋巴细胞缺失的恒河猴动物模型提供基础的实验数据。方法选取健康的中国恒河猴两只,静脉滴注抗人B淋巴细胞单克隆抗体,定期采集外周血、腹股沟淋巴结和十二指肠黏膜组织,制备淋巴细胞悬液,应用流式细胞术的方法系统性测定B淋巴细胞及T淋巴细胞亚群的变化。结果静脉滴注利妥昔单抗注射液后24 h,中国恒河猴外周血中B淋巴细胞的缺失即能达到100%,持续约14 d;腹股沟淋巴结中B淋巴细胞在静注后7 d缺失100%;十二指肠黏膜组织中B淋巴细胞在静脉滴注后7 d缺失达到90%,维持28 d。并且在成功敲除B淋巴细胞的情况下,CD4＋T及CD8＋T淋巴细胞无明显波动,维持在一个稳定的水平。结论利妥昔单抗注射液能有效去除中国恒河猴体内B淋巴细胞,为建立B淋巴细胞缺失动物模型奠定基础。     

SHIV病毒在猴体内的复制与传代

目的为建立SHIV艾滋病动物模型提供毒力较强的病毒株,将新合成的SHIV XJ02170病毒适应猴体,并增强其毒力。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查和PCR检测。选出13只无SIV,STLV1,SRV D和B病毒感染的猴。第一批实验,将SHIV前病毒DNA质粒经肌肉注射到猴体内,每只500μg;SHIV病毒液,经静脉注射到猴体内,每只2ml。病毒质粒和病毒液各接种2只猴。当第一批猴体检出病毒后,10ml感染猴的全血,抗凝后静脉注射到第二批猴体内,当第二批猴检出病毒后再将10ml感染猴的全血静脉注射到第三批猴体内,连续传代4次。每批实验均定期采集血液标本,分别用肝素和EDTA抗凝,进行病毒分离;病毒基因PCR检测;CD4,CD8测定;病毒抗体检测。结果SHIV XJ02170病毒和SHIV XJ02170前病毒DNA质粒在猴体内的传代中均能分离出病毒;从传代猴的血浆和外周血单核细胞(PBMC)中检出了病毒DNA和RNA基因;CD4,CD8测定结果显示有暂时性倒置现象,后变为正常倒置与正常交替出现;在传代的猴血清中检测出特异性HIV病毒抗体。结论SHIV XJ02170病毒与SHIV XJ02170前病毒DNA质粒,均能在恒河猴体内复制。     

亚热带典型森林地上和地下凋落物输入对土壤新老有机碳动态平衡的影响

凋落物是森林土壤有机碳(SOC)形成、稳定和周转的重要影响因子。目前针对亚热带不同类型森林地上和地下凋落物对新SOC累积和老SOC输出动态平衡的影响仍不清楚。本研究以中亚热带常绿阔叶天然林、马尾松人工林和杉木人工林为对象,基于C3/C4植物-土壤置换试验,利用稳定同位素¹³C示踪方法开展3年野外定位试验,分析了森林地上、地下凋落物输入对SOC周转的影响。结果表明: 森林类型、凋落物处理和时间均能显著影响SOC含量、土壤δ¹³C值、新SOC和老SOC含量,且存在显著的森林类型×凋落物处理交互效应。地上和地下凋落物输入均能显著提高SOC含量和净增量,与杉木人工林相比,天然林SOC对凋落物输入的响应更敏感。凋落物输入显著降低了土壤δ¹³C值,且天然林、马尾松人工林土壤δ¹³C显著低于杉木人工林。在马尾松人工林,地下凋落物处理的新SOC含量显著高于地上凋落物;在天然林和马尾松人工林,地下凋落物输入处理的老SOC含量显著低于地上凋落物处理。此外,地上凋落物归还量和地下根生物量与SOC含量和净增量呈显著正相关,而地下根凋落物量和C/N与新SOC含量呈显著正相关。森林地下凋落物比地上凋落物输入对SOC周转的影响更重要,且不同森林凋落物输入对SOC的影响存在差异性。本研究可为揭示亚热带典型森林土壤有机碳库的形成和可持续管理提供依据。     

猴免疫缺陷病毒（SIV）在艾滋病模型恒河猴组织中的分布和载量测定

目的研究当艾滋病恒河猴模型的血浆病毒载量处于低水平或阴性时,猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency viruses,SIV）在宿主组织中的分布情况。方法SIVmac251感染恒河猴10只,定期检测其血浆载量,感染病毒平均高峰时间第14天时,活检取淋巴结。选取感染18个月后病毒载量最低水平和阴性的2只艾滋病猴（SAIDS）,经安死术后取淋巴结、脾、肝、肺、肾、脑等组织,用原位杂交和实时荧光定量PCR的方法检测病毒在组织中的分布和组织中的病毒载量。结果感染后14d,10只猴血浆病毒载量达到10^7copies/mL,淋巴结组织病毒载量为10^5-10^8copies/g,原位杂交方法在腹股沟淋巴结中检测到强阳性斑点。感染后第18个月的2只猴,血浆病毒载量下降并维持不高于10^2copies/mL水平或阴性,但组织分布不尽相同,在肠系膜淋巴结、肾上腺、海马回、空肠、脾脏等组织中检测到10^5-10^6copies/g的病毒载量,于一只猴的脑积液中检测到10^3copies/mL的病毒载量。用原位杂交的方法在肠系膜淋巴结和空肠中检测到强阳性斑点,其它组织中未检测到阳性斑点。结论实验证实SAIDS猴在血浆病毒载量低甚至阴性时,病毒在不同组织中仍有分布,有些组织中甚至出现高病毒载量,提示在制备SIV/SAIDS模型中,尤其在药物筛选和疫苗评价时,应考虑组织病毒载量指标的测定和药物、疫苗对组织病毒的治疗清除作用的评价。     

SHIV-XJ02170感染恒河猴后期的传代特点和env基因变异

目的研究SHIV-XJ02170在中国恒河猴感染后期传代过程中病毒和宿主的变化特点,并分析env基因的序列变异。方法将感染中国恒河猴G0401V后期（5年）的SHIV-XJ02170病毒垂直传代2只猴（G0401V→G0402V→0403V）,同时,剔除G0401V猴CD8＋T细胞使潜伏的病毒大量复制后传代1只猴（G0401V→G0404V）,应用流式细胞术、病毒载量测定、序列分析等方法研究该病毒在猴体内长期适应后的病毒和免疫学指标及序列变异特点。结果 G0401V在感染后期仍能稳定传代,且表现出毒力增强的特点。其传代猴G0402V在传代后41 d死亡,外周血CD4＋T淋巴细胞衰竭,仅为43个/mL,符合艾滋病感染猴快速进展型的特征。剔除体内CD8＋T细胞之后的传代猴G0404V的表现类似G0401V,即长期低水平的病毒血症水平。env基因序列分析发现SHIV-XJ02170在G0401V体内长期适应后发生了可遗传的序列变异,并引起糖基化位点的改变。结论 SHIV-XJ02170在猴体长期适应后的传代过程中表现出向强毒株过渡的特征,为进行SHIV-XJ02170感染性克隆的构建奠定了良好的实验基础。     

SHIV1157ipd3N4中国恒河猴细胞适应株静脉感染中国恒河猴有效浓度的确定

目的确定SHIV1157ipd3N4静脉途径感染中国恒河猴的有效病毒浓度,明确SHIV1157ipd3N4感染实验猴体内病毒复制和免疫损伤情况。方法 10只正常中国恒河猴分成6组,分别用10倍系列稀释的病毒液1 mL静脉感染,测定血浆病毒载量,CD4＋/CD8＋,CD4＋T淋巴细胞绝对数,分析感染后恒河猴体内病毒复制和免疫损伤情况。结果 5TCID50/mL以上浓度的SHIV1157ipd3N4能通过静脉途径感染中国恒河猴。结论该实验的成功进行为SHIV/中国恒河猴疾病及评价模型的建立奠定了良好的基础,为今后使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。