c-abl 通过与雌激素受体β相互作用上调其转录活性

雌激素受体β(ERβ)在心血管疾病发生发展中起着重要的作用,但是其在心血管病中发挥作用的机制还不清楚.因此寻找与ERβ相互作用的共调节因子对阐明ERβ信号通路具有重要价值.应用GST沉淀、免疫共沉淀技术,发现ERβ可以与c-abl相互作用,并可被c-abl磷酸化.通过荧光素酶报告基因方法发现,c-abl可以上调ERβ转录激活的活性,并且上调作用可以被c-abl的抑制剂STI571抑制.上述结果提示c-abl是新的ERβ共刺激因子,为进一步研究ERβ通路在心血管疾病中发挥作用的机制打下基础.     

5型腺病毒E1A基因通过调控GP73的表达抑制肝癌细胞增殖的初步研究

目的:研究5型腺病毒(Ad5)E1A基因通过调控高尔基蛋白73(GP73)的表达水平,抑制肝癌细胞Hep G2的增殖。方法:以腺病毒为模板、pc DNA-flag-Vector为载体,构建真核表达载体pc DNA3-Flag-Ad5E1A;免疫印迹实验鉴定重组蛋白Ad5E1A的表达;免疫印迹实验验证Ad5E1A对GP73表达水平的影响;将Ad5E1A基因转染Hep G2细胞,用CCK-8试剂盒检测Hep G2细胞的增殖情况。结果:免疫印迹实验结果证实,真核表达载体pc DNA3-FlagAd5E1A在HEK293细胞中得到表达;Ad5E1A可明显抑制GP73的表达。酶标仪检测发现,与转染Flag-GP73组相比,Ad5E1A组的抑制率为17.5%,差异无统计学意义(P0.05);而与转染Flag-GP73组比,共转Ad5E1A和GP73组的抑制率为37.8%,差异有统计学意义(P0.05)。结论:Ad5E1A基因通过调控GP73的表达抑制了肝癌细胞Hep G2的增殖。为研究肝癌发生机制,开发新型治疗方案提供了实验基础。     

人TBK1小干扰RNA质粒的构建及稳定干扰TBK1细胞株的筛选

目的:构建人TANK结合激酶1(TBK1)的小干扰RNA真核表达质粒,并筛选出稳定干扰TBK1的细胞株。方法:根据文献报道的序列和载体的黏性末端,设计合成2条针对TBK1的DNA序列,退火后连接到载体pSUPER.retro.neo+gfp上,经测序分析正确后得到质粒psiTBK1。用脂质体转染质粒psiTBK1到MCF-7细胞中,经G418加压筛选稳定表达TBK1小干扰RNA的细胞株,用免疫印迹检测细胞中TBK1的表达情况,将干扰效果好的细胞株命名为MCF-7/siTBK1,再用萤光素酶试验检测MCF-7/siTBK1细胞对外源TBK1诱导干扰素-β(IFN-β)转录的情况。结果:免疫印迹结果证实建立的稳定细胞株MCF-7/siTBK1能够有效干扰TBK1的表达,并在外源TBK1存在的情况下抑制IFN-β的转录活性。结论:构建了表达TBK1小干扰RNA的质粒psiTBK1,筛选出稳定干扰TBK1表达的细胞株MCF-7/siTBK1,为深入研究TBK1在先天免疫中的作用提供了平台。     

CXCL1促进内质网应激在肝癌肿瘤微环境中传递

目的:研究趋化因子1(CXCL1)对肝癌肿瘤微环境中肿瘤细胞间及肿瘤细胞和巨噬细胞间内质网应激(ERS)的作用。方法:收集受衣霉素(TM)刺激的HepG2细胞的上清作为条件培养基,用于培养未受TM刺激的HepG2和THP-1细胞,检测培养基中未折叠蛋白反应(UPR)相关蛋白IRE1、PERK和ATF6的mRNA表达,构建ERS在细胞间传递的模型;合成si-CXCL1,瞬时转染HepG2细胞,RT-PCR检测HepG2细胞的CXCL1的转染效率,ELISA检测上清中CXCL1的表达水平;TM刺激CXCL1敲低的HepG2细胞,收集其上清用于培养未受TM刺激的HepG2和TPH-1细胞,RT-PCR检测HepG2细胞和THP-1细胞中UPR相关的IRE1、PERK及ATF6的mRNA表达。结果:用TM刺激后的条件培养基培养HepG2和TPH-1细胞时,2种细胞中的IRE1、PERK、ATF6表达均上调,构建了ERS在细胞间传递的模型;si-CXCL1转染HepG2细胞后,与对照组相比,si-CXCL1组HepG2细胞中CXCL1的表达降低,同时ELISA检测培养基中的CXCL1也降低;用TM刺激CXCL1敲低的HepG2细胞的上清培养未受TM刺激的HepG2和TPH-1细胞后,与对照组相比,CXCL1血清敲低组培养的细胞中IRE1、PERK和ATF6的mRNA水平均下降。结论:CXCL1能够促进肝癌肿瘤微环境中内质网应激在细胞间传递。     

人TANK结合激酶1的基因克隆、表达及生物活性鉴定

目的:克隆人TANK结合激酶1(TBK1)基因,构建其真核表达载体,检测该基因在293细胞中的表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测其生物活性。方法:应用RT-PCR方法,以HeLa细胞RNA为模板,扩增获得TBK1基因,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中,以LipofectAMINE2000转染试剂转染pcDNA-Flag-TBK1至293细胞中进行瞬时表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测诱导β干扰素(IFN-β)转录的情况。结果:测序结果表明,从人HeLa细胞总RNA中克隆到正确的TBK1基因全长编码序列,利用Western印迹检测其在293细胞中获得有效表达,利用萤光素酶报告基因实验检测TBK1可以诱导IFN-β转录激活。结论:真核表达的人TBK1具有相应的生物学活性,为研究其功能奠定了基础。     

TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体的构建、表达及生物活性鉴定

目的:构建TANK结合激酶1(TBK1)相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体真核表达载体,检测该基因相关突变体在293细胞中的表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测其生物活性。方法:根据文献报道的突变序列及QuickChange Site-Directed Mutagenesis实验设计手册,设计合成2条针对TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体的引物,以实验室之前构建的TBK1野生型真核表达载体为模板,构建TBK1激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体真核表达载体,分别命名为pcDNA3-Flag-TBK1(KD)、pcDNA3-Flag-TBK1(ΔULD)。以LipofactAMINE2000转染试剂转染至293细胞中进行瞬时表达,利用萤光素酶实验检测2种TBK1突变体诱导β干扰素(IFN-β)转录的情况。结果:测序结果表明,TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域缺失突变体真核表达载体构建成功,Western印迹检测表明其在293细胞中获得有效表达;用萤光素酶报告基因实验检测,与野生型TBK1相比,其相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域缺失突变体诱导IFN-β转录激活的作用明显降低。结论:真核表达的TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体具有相应的生物学活性,为研究其功能奠定了基础。