顺铂作用卵巢癌细胞株的蛋白质组学研究

应用蛋白质组学技术观察顺铂作用于人卵巢癌SKOV3细胞株后蛋白质分子的表达差 异, 探讨蛋白质组学方法在化疗药物抗肿瘤作用机制研究方面的应用. 用顺铂(6 mg/mL)作用人卵巢癌SKOV3细胞6 h, 分别收集实验组与对照组细胞, 裂解并提取细胞内总蛋白; 以固相IPG胶条(17 cm, pH4~7)为载体, 进行第一向等电聚焦和第二向SDS-PAGE电泳, 得到实验组与对照组双向电泳凝胶图; 经考马斯亮蓝染色后, 在PDQuest软件的辅助下进行实验组与对照组蛋白质表达的比较, 选择并切取明显差异点共11个, 经肽质量指纹谱(PMF)和串级质谱(MS/MS)分析, 检测出差异点中包含的主要蛋白. 通过质谱分析显示, 顺铂处理后表达明显上调的有原肌球蛋白家族、肌动蛋白家族、热休克蛋白60(HSP60)、磷酸丙糖异构酶(TIM)家族等; 表达下调的有烯醇酶家族等. 这几类蛋白质多参与细胞内能量代谢、细胞形态维持、细胞转化凋亡等生理过程, 提示顺铂的抗肿瘤机制可能与此有关.     

抗肿瘤血管生成免疫治疗的研究进展

肿瘤的生长和转移依赖血管生成, 近年来抗血管生成治疗肿瘤已取得了较大的进展, 在被动免疫治疗方面, 重组的人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体Avastin已正式被美国食品及药物管理局批准为抗肿瘤血管生成药物, 这是迄今第一个抗肿瘤血管生成的生物制剂; 在主动免疫治疗方面, 通过多种途径如异种同源分子的交叉免疫反应或树突状细胞的抗原递呈功能等成功突破了机体对自身抗原的免疫耐受, 产生了较好的抗肿瘤血管生成作用. 本文就近年来抗肿瘤血管生成免疫治疗方面的研究和进展做一综合论述.     

OX-M-AdmCLB1重组腺病毒制备及其诱导的体内抗肿瘤效应

构建小鼠细胞周期蛋白B1(mcyclinB1)重组腺病毒(AdmCLB1),将氧化型甘露聚糖(OX-M)与AdmCLB1偶联,制备OX-M-AdmCLB1,研究OX-M-AdmCLB1诱导的抗肿瘤效应。利用AdEasy系统构建携带靶基因小鼠细胞周期蛋白B1的复制缺陷型重组腺病毒AdmCLB1,抽提AdmCLB1基因组DNA,进行PCR扩增。重组病毒经扩增、纯化后与OX-M混合,制备OX-M-AdmCLB1;OX-M-AdmCLB1体外感染小鼠树突状细胞(DC),RT-PCR扩增分析靶基因表达;OX-M-AdmCLB1处理BALB/C小鼠,处理后再荷瘤,观察小鼠肿瘤生长及生存情况。重组病毒AdmCLB1终滴度为2.1×1011pfu/ml;DC内靶基因的表达量在OX-M-AdmCLB1组较AdmCLB1组高;体内研究提示OX-M-AdmCLB1可明显抑制CT26肿瘤增殖(抑瘤率44%)、延长动物生存期(P<0.01)。实验制备的新型重组腺病毒OX-M-AdmCLB1体内能够诱导明显的抗肿瘤效应,估计此效应的产生与DC特异识别OX-M-AdmCLB1,进而激活机体抗肿瘤免疫有关。     

利用核糖体展示技术筛选功能性蛋白质方法的建立

核糖体展示(ribosomedisplay)是一种体外筛选功能性蛋白质的有力的工具.利用体外转录和翻译偶联系统可以方便而快捷地完成核糖体展示.筛选系统利用一对能够紧密结合的蛋白质:人锚蛋白(ankyrin)和红血球膜带3蛋白细胞质区域(cytoplasmicdomainoferythrocytemembraneproteinBand3,Cdb3)作为模式分子,希望利用cdb3蛋白通过核糖体展示亲和选择得到锚蛋白基因.用于核糖体展示的人锚蛋白基因结构由组装PCR构建,通过PCR技术引入核糖体展示所需的结构元件.在亲和筛选步骤后,只能利用红血球膜带3蛋白筛选得到锚蛋白基因,而不能利用对照牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)筛选得到,从而说明建立的核糖体展示技术能够正常发挥作用.     

AS-mCLB1重组质粒体外抗肿瘤及化疗增敏作用

研究反义全长小鼠细胞周期蛋白B1重组质粒(pAS-mCLB1)体外抗肿瘤及化疗增敏作用。扩增后少量抽提并纯化pAS-mCLB1,通过脂质体将其转染入小鼠露易丝肺癌(LL/2)细胞,RT-PCR和Western印迹测定细胞内细胞周期蛋白B1的表达,观察转染后细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡。细胞转染48h后,用化疗药物健择(gemcitabine;0.2μmol/L)处理24h,MTT法测定健择对细胞的杀伤作用。研究提示pAS-mCLB1转染后LL/2细胞形态明显异常,细胞内细胞周期蛋白B1表达显著下调,细胞周期阻滞于G1期,增殖受抑,凋亡增加;健择对pAS-mCLB1转染后LL/2细胞的杀伤作用显著增强。重组质粒pAS-mCLB1体外具有明显的抗肿瘤作用,并能增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,估计上述作用与其下调肿瘤细胞内细胞周期蛋白B1表达,从而诱导细胞周期阻滞及凋亡等作用相关。     

斑马鱼新基因KLP的筛选、克隆及初步分析

通过重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)获得来自斑马鱼的cDNA序列,提取斑马鱼总RNA通过RT-PCR得到该基因全长共5171 bp编码1574个氨基酸,运用生物信息学研究工具进行分析显示该基因为一新基因,命名为KLP,在斑马鱼胚胎各个发育时期用RT-PCR检测该基因的表达情况发现:在斑马鱼早期胚胎发育的几个重要时期该基因都有高表达。该基因含有8个锌指结构,其中3个KAISO蛋白特征性的C2H2锌指结构,且此区域在多个物种内高度保守,提示其在胚胎发育早期过程中具有非常重要的作用。     

医药生物技术研究与产业化进展

当今世界上许多国家特别是发达国家都把发展生物技术及其产业作为提高本国科技和经济竞争力的重要手段。医药生物技术是生物技术首先取得突破 ,实现产业化的技术领域 ,世纪之交的医药生物技术呈现出蓬勃发展态势。美国在医药生物技术领域占据了世界领先地位 ,各种生物技术产品被广泛应用于医疗、制药等行业 ,医药生物技术已成为美国高技术产业发展的核心动力之一。近年来 ,我国的医药生物技术研发和产业化取得了长足的进展 ,在基因工程药物和疫苗、单抗导向药物、人工血液代用品、生物芯片的研制 ,疾病相关基因的定位和克隆、体细胞克隆、遗传病的基因诊断技术、基因治疗、肿瘤免疫治疗、抗血管治疗、组织工程、干细胞的研究等方面均取得了可喜成果 ,逐步缩短了与先进国家的差距。本文综述了近年来医药生物技术领域的研究、开发和产业化现状 ,并对加速我国医药生物技术及其产业的发展提出了一些建议。     

TnI-fast基因表达抑制卵巢癌移植瘤生长

为探讨利用TnI-fast 基因进行卵巢癌基因治疗的有效性及其机制, 将TnI-fast基因 cDNA转染人卵巢癌细胞系SKOV3. 采用MTT法和流式细胞技术分别检测TnI-fast基因转染、空载体转染和未转染的SKOV3细胞体外生长状态. 收集3种细胞培养上清液, 检测3种培养上清液对人脐静脉内皮细胞增殖抑制效应. 3种细胞分别接种到裸鼠, 观察肿瘤生长、细胞凋亡、肿瘤血管生成和TnI-fast基因局部表达. 体外试验发现, 与空载体转染和未转染的SKOV3细胞比较, TnI-fast基因表达对肿瘤细胞自身的生长无抑制作用, 但可抑制人脐静脉内皮细胞增殖. 动物实验中, TnI-fast基因表达可显著抑制肿瘤生长, 生长抑制率达73%. 其肿瘤细胞增殖率与对照组相当, 但微血管密度显著降低, 细胞凋亡显著增加. 提示, 肿瘤自身血管生成抑制可显著延缓卵巢癌生长. 利用血管生成特异性抑制基因TnI-fast进行抗肿瘤血管生成基因治疗可作为肿瘤治疗的新策略之一.     

分子模拟与微生物、自身免疫交叉识别以及肿瘤免疫治疗

分子模拟是生物界广为存在的一种自然现象。细菌等病原微生物可利用蛋白质序列或结构的相似而模拟宿主细胞某些分子的功能,从而协助其入侵与存活;另一方面,微生物也可因某些蛋白质的同源或相似而致宿主交叉免疫反应,导致自身免疫参与自身免疫疾病的发生,其本质是一种交叉识别。本室及其他研究小组发现可利用不同种属某些肿瘤相关同源分子的异源性激发特异的免疫反应,并因其同源性而交叉反应于宿主分子,从而产生抗肿瘤的自身免疫,亦即通过异种同源分子的策略主动免疫治疗肿瘤。这种模拟还可以在表位肽的水平进行,相信分子模拟的深入研究将有助于揭示进化与分子识别的本质以及自身免疫的规律,从而探索分子模拟在疾病预防与治疗中的应用。     

热休克蛋白对细胞凋亡信号转导途径的调节

细胞凋亡信号转导目前已迅速成为揭示细胞凋亡分子机制的前沿课题. 由于热休克蛋白(HSPs)在细胞生长调控和凋亡中发挥的重要作用, 人们进行了大量关于热休克蛋白与细胞凋亡信号转导途径调节机制的研究. 研究发现, 热休克蛋白家族的多个成员, 如HSP90, HSP70, HSP60, HSP27等能够在Fas死亡受体途径、JNK/SAPK途径、caspase途径等多个水平发挥调节作用, 并且部分依赖于热休克蛋白的“分子伴侣”作用, 控制着细胞生命进程.