人白细胞介素-3基因在酿酒酵母中的分泌表达

利用PCR突变方法,改造了人白细胞介素-3(hIL-3)cDNA,在成熟蛋白编码顺序5＇端前突变入了XbaⅠ酶切位点和酵母类胰蛋白酶加工位点Lys-Arg的密码子。改造后的hIL-3cDNA插入大肠杆菌-酵母穿梭质粒pVT102u/α,使其准确融合于α-交配因子前导序列之后,并置于启动子ADH1调控之下。转化入酿酒酵母宿主菌S-78筛选后,30℃培养48h,上清能明显促进hIL-3依赖细胞TF-1生长。上清中分泌表达的hIL-3经ELISA鉴定并定量,其表达量大于1.0mg/L。~3H-TdR掺入法测定上清中hIL-3活性为1.8×10~3u/ml。     

人α降钙素基因相关肽与肿瘤坏死因子的融合表达

用半酶和半化学合成的方法合成和克隆了人ａ降钙素基因相关肽基因,将该基因融合在肿瘤坏死因子之后插入表达载体ｐＳＢ－９２中,使融合基因的５＇端直接置于大肠杆菌ＰＬ启动下游,采用３０℃培养,４２℃诱导,使ＴＮＦ与ＣＧＲＰ融合蛋白在大肠杆菌中获得了表达,表达的融合蛋白既有ＣＧＲＰ的结合活性（酶标检测为阳性）又有ＴＮＦ的生理功能（对Ｌ－９２９细胞的细胞毒活性）。表达菌裂解液走ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳,显示     

一种新型人肿瘤坏死因子突变体在大肠杆菌中的高效表达

采用多位点突变引物和ＰＣＲ方法对合成的人肿瘤坏死因子进行了突变,通过这一突变,人肿瘤坏死因子的第二位精氨酸的密码子ＣＧＴ被变为赖氨酸密码子ＡＡＡ,将突变后的基因插入表达载体ｐＳＢ－９２的ＰＬ启动子下游得到重组质粒ｐＳＢ－ＴＮＦ－Ｋ２,并在大肠杆菌中进行表达。突变体［Ｌｙｓ２］ｈＴＮＦ－α的表达产率达到菌体内总蛋白质的６０％以上,且为一可溶性蛋白质并易于纯化。同野生型ｈＴＮＦ－α相比,［Ｌｙｓ２］ｈＴＮＦ－α具有稍低的毒性,但对于某些人肿瘤细胞株表现出高于数十到数百倍的抑制活性．     

人α降钙素基因相关肽基因在酵母细胞中的分泌表达与产物的分离纯化

化学合成的人α降钙素基因相关肽(CCRP)基因用PCR法改造后使其能正确融合在酵母分泌型表达载体pVT102U/α中的α交配因子前导肽序列之后,然后进行克隆并转化酵母宿主菌S－78进行表达．培养物的上清用酶标(ELlSA)鉴定为阳性,而对照S－78、pVT102u／α为阴性,表达量用ELISA定量大于2mg／L。表达产物经阳离子交按层析(CM—Sphadex C₂₅)和HPLC纯化得到了HPLC纯产品。纯化后的CGRP能引起小鼠血压的降低,说明表达的目的蛋白既有CGRP的免疫结合活性,又有CGRP的生理活性。测定其N－端10个氨基酸序列,证明人工合成的CGRP基因在酵母细胞中已正确表达。     

人白细胞介素-3基因在酿酒酵母中的分泌表达

利用PCR突变方法,改造了人白细胞介素-3(hIL-3)cDNA,在成熟蛋白编码顺序5＇端前突变入了XbaⅠ酶切位点和酵母类胰蛋白酶加工位点Lys-Arg的密码子。改造后的hIL-3cDNA插入大肠杆菌-酵母穿梭质粒pVT102u/α,使其准确融合于α-交配因子前导序列之后,并置于启动子ADH1调控之下。转化入酿酒酵母宿主菌S-78筛选后,30℃培养48h,上清能明显促进hIL-3依赖细胞TF-1生长。上清中分泌表达的hIL-3经ELISA鉴定并定量,其表达量大于1.0mg/L。³H-TdR掺入法测定上清中hIL-3活性为1.8×10³u/ml。     

人肿瘤坏死因子及其突变体的基因工程下游工艺研究

研究了重组人肿瘤坏死因子(rhTNFα)及其突变体[Lys²]-人肿瘤坏死因子[Lys²]-rhTNFα)的基因工程下游工艺。rhTNFα和[Lys²]-rbTNFα的温控表达工程菌株在B-BTaunE 10型15L自控罐中经发酵每升可得50g湿菌体。rhTNFα和[Lys²]-rhTNFα的表达水平仍能保持在50％以上,且表达产物为可溶性蛋白。所得菌体经超声破菌、硫酸铵沉淀,然后依次用DEAE—Sepharose FF、CM-Sepharose FF和Sephacryl S-200柱层析进行分离纯化,由每升发酵液菌体最终可得1g左右的纯品,纯度达到98％左右,rhTNFα的比活为～1.5×10⁸IU／mg,[Lys²]－rhTNα的比活为～6×10⁸IU／mg。     

人a降钙素基因相关肽基因在酵母细胞中的分泌表达与产物的分…

化学合成的人ａ降钙素基因相关肽（ＣＧＲＰ）基因用ＰＣＲ法改造后使其能正确融合在酵母分泌型表达载体ｐＶＴ１０２Ｕ／ａ中的ａ交配因子前导肽序列之后,然后进行克隆并转化酵母宿主菌Ｓ－７８进行表达,培养物的上清用酶标（ＥＬＩＳＡ）鉴定为阳性,而对照Ｓ－７８、ｐＶＴ１０２Ｕ／ａ为阴性,表达量用ＥＬＩＳＡ定量大于２ｍｇ／Ｌ。表达产物经阳离子交换层析（ＣＭ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ２５）和ＨＰＬＣ纯化得到了ＨＰＬＣ