β-甘露聚糖酶和木聚糖酶基因在大肠杆菌中共表达

【目的】β-甘露聚糖酶和木聚糖酶都属于半纤维素酶,它们已经同时运用于工农业生产的许多领域。构建β-甘露聚糖酶和木聚糖酶共表达菌株并进行相关评价。【方法】通过设计一个共同的酶切位点,将菌株Bacillus subtilis BE-91中的β-甘露聚糖酶和木聚糖酶基因串联到表达载体pET28a(+)上,转化大肠杆菌构建了一株能够共表达β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的菌株B.pET28a-man-xyl。【结果】菌株诱导21 h后,发酵液中β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的酶活分别为713.34 U/mL和1455.83 U/mL,是胞内酶活的11.8倍和2.53倍。【结论】SDS-PAGE分析、水解圈活性检测和胞外酶与胞内酶酶活检测表明:两个酶均以功能蛋白独立分泌到胞外。此外,与β-甘露聚糖酶和木聚糖酶单独酶解半纤维素相比,复合酶的酶解效果更好。菌株的成功构建为复合酶制剂(半纤维素酶制剂)的研究和生产奠定基础。     

一种新的延胡索酸水合酶抗体的制备及功能研究

延胡索酸水合酶(fumarate hydratase,FH)是三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)中的一个关键性酶。FH的基因突变将导致延胡索酸合酶缺乏症、遗传性平滑肌瘤和肾细胞癌(hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma,HLRCC)等疾病。FH缺失导致HLRCC分子的确切生物学机制尚不明确。作者将FH基因片段克隆到原核表达载体上,在大肠杆菌中表达GST-FH(400-510)融合蛋白。该融合蛋白为抗原免疫小鼠获得抗体,通过免疫印迹实验证明了该抗体的特异性并发现FH在心脏和肝脏中的含量较高。通过免疫共沉淀实验发现,在大鼠肝脏组织中FH可能与多个蛋白形成蛋白复合物。     

人源酪蛋白激酶Ⅱ催化亚基的构建及表达纯化

目的:构建人源CK2催化亚基pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2重组质粒,并进行原核表达纯化得到高纯度融合蛋白,为进一步开展CK2生理病理机制研究以及CK2作为肿瘤抑制靶点相关抑制剂的筛选和评价提供实验基础。方法:利用合成的人源csnk2a1和csnk2a2目的基因片段,将酶切连接得到的重组质粒经测序验证后,进行大肠杆菌感受态BL21 (DE3)/Transetta (DE3)转化。使用合适浓度IPTG诱导融合蛋白的表达以得到可溶性的融合蛋白,并应用AKTA avant蛋白纯化仪和Ni2+-NTA预装柱进行纯化,蛋白纯度最后经SDS-PAGE胶分离后考马斯亮蓝染色和Western Blot检测鉴定。结果:测序结果表明pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2质粒均成功被构建;经转化诱导表达后,成功纯化得到相对分子量为42KD的his-hcsnk2a1和38KD的his-hcsnk2a2目的融合蛋白。结论:首次成功构建得到pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2质粒;并表达纯化得到高浓度和高纯度的his-hcsnk2a1和his-hcsnk2a2融合蛋白,为后期的蛋白功能研究和抑制剂筛选评价提供了基础。