大剂量国产胸腺肽联合干扰素治疗慢性乙肝疗效及其机理初探

本文研究大剂量胸腺肽联合干扰素对慢性乙肝患者的治疗作用,发现胸腺肽联合干扰素治疗三个月后,患者的ＡＬＴ复常率、ＨＢｅＡｇ转阴率、ＨＢＶＤＮＡ阴转率和ＨＢＶＤＮＡ有效下降率分别为７６０％、４４０％、５６０％和９６０％。Ｔ淋巴细胞亚群分析结果表明,联合治疗后,患者外周血ＣＤ４＋淋巴细胞亚群上调,ＣＤ８＋亚群下调,二者比值趋于正常,说明国产胸腺肽联合干扰素治疗慢性乙肝的治疗机理与免疫调节作用有关。     

蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B催化活性区的原核表达及活性分析

从GenBank获得人PTP1B催化活性区(PTP1Bc)氨基酸序列(1~301aa), 通过重叠PCR获得PTP1Bc基因。构建 pET-22b(+)/PTP1Bc原核表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 阳性重组子IPTG诱导表达, Ni柱纯化蛋白。目的蛋白以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白30%以上。纯化后, 蛋白纯度达95%以上。Western blotting结果表明所得的蛋白可与抗 PTP1B抗体发生特异性结合; 酶活实验证实复性的蛋白具有一定的磷酸酶活性。PTP1Bc基因的构建、表达纯化及活性分析, 为进一步的功能研究奠定了基础。     

蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B催化活性区的原核表达及活性分析

从GenBank获得人PTP1B催化活性区(PTP1Bc)氨基酸序列(1~301aa), 通过重叠PCR获得PTP1Bc基因。构建 pET-22b(+)/PTP1Bc原核表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 阳性重组子IPTG诱导表达, Ni柱纯化蛋白。目的蛋白以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白30%以上。纯化后, 蛋白纯度达95%以上。Western blotting结果表明所得的蛋白可与抗 PTP1B抗体发生特异性结合; 酶活实验证实复性的蛋白具有一定的磷酸酶活性。PTP1Bc基因的构建、表达纯化及活性分析, 为进一步的功能研究奠定了基础。     

重组人瘦素的基因构建、表达及活性鉴定

根据NCBI中公布的人瘦素cDNA序列,设计并合成了6个89bp左右的DNA小片段,经重叠延伸PCR扩增获得464bp的rhLep的完整基因片段。构建pET22b( )/rhLep表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的50%以上。表达产物用Ni2 亲和层析柱纯化,SDS-PAGE结果表明,含6×His标签的目的蛋白的相对分子量约16kD。MTT比色法实验显示,当低剂量(10~30ng/mL)时,rhLep具有促进内皮细胞生长的作用;在高剂量(50~225ng/mL)时,rhLep具有杀伤人内皮细胞的活性。其最大杀伤率达到98.8%。吖啶橙荧光染色观察到高剂量rhLep对人内皮细胞有明显的凋亡作用。以上工作为进一步了解瘦素的体内体外生物活性奠定了基础。     

凝血靶向通用效应因子tTF/SA融合蛋白的表达及活性鉴定

制备凝血靶向通用效应因子tTF/SA融合蛋白,并鉴定其生物学活性。利用PCR技术构建tTF与链霉亲和素SA的融合基因,克隆至表达载体pET22b( ),在E.coliBL21(DE_3)中表达,镍亲和层析柱纯化tTF/SA融合蛋白。凝血实验和FⅩ活化实验鉴定融合蛋白中tTF的活性,ELISA鉴定融合蛋白中SA与生物素Biotin结合的活性。获得序列正确的tTF/SA/pET22b( )重组子,融合基因在E.coliBL21(DE_3)中高效表达。纯化后的融合蛋白具有活化FⅩ、引起血液凝固的能力,且能与生物素结合。融合基因已成功在E.coliBL21(DE_3)中表达,tTF/SA融合蛋白具有TF和SA活性。融合蛋白tTF/SA可作为通用效应因子,与生物素化的肿瘤组织血管特异性载体联用,实现选择性诱发肿瘤组织血管栓塞的多点治疗。     

131Ⅰ－McAbJH_（107）在载人肝癌BEL－7402裸鼠体内的放射免疫显像分析

用氯胺Ｔ碘标技术标记抗人肝癌单克隆抗体ＪＨ１０７（ＭｃＡｂＪＨ１０７）,观测其在载人肝癌ＢＥＬ７４０２裸鼠模型上的分布显像情况,氯胺Ｔ碘标法标记率５０％。每鼠腹腔注射２００Ｃｉ１３１Ⅰ－ＭｃＡｂＪＨ１０７,放射性物质第２４ｈ开始在肿瘤部位浓聚、逐步加强,９６ｈ达高峰,肿瘤组织较清楚显像并维持至１４８ｈ;同时周围组织放射性本底逐步减弱、消失。对照组１３１Ⅰ－ＮＩｇＧ呈全身均匀分布。无明显放射性物质浓聚及清楚显像。在４８ｈ和９６ｈ,１３１Ⅰ－ＭｃＡｂＪＨ１０７在１２种正常组织（脑除外）的Ｔ／ＮＴ均值分别为３．３８和６．２６,而１３１Ⅰ－ＮＩｇＧ的Ｔ／ＮＴ均值均低于１．０。     

人肝癌细胞株H9101的建立及其细胞生物学特性研究

从厦门市肝癌高发的同安地区肝癌病人肝癌组织建立了人原发性肝细胞癌细胞系H9101.它生长迅速,群体倍增时间平均为38小时,对小牛血清的依赖性较低(1%).体外培养的H9101细胞贴壁生长,扫描和透射电镜下见细胞有丰富细长微绒毛.H9101细胞具有较高的软琼脂克隆形成率(1/200细胞)和裸鼠异种移植成瘤能力(100%).瘤细胞在ConA处理后呈较强的凝集性,在ConA 50ug/ml和100μg/ml时细胞凝集率分别为61%和92%.瘤细胞分泌微量的AFP,用1%DMSO和1.5×10-5mol/L地塞米松处理10天后上升到(140ng/ml/1×105细胞/24小时),且HBsAg转呈阳性.H9101细胞γ-谷氨酰转肽酶活性达5.42U±0.11U/mg,酪氨酸α酮戊二酸转肽酶活性达14.24U±1.50U/mg,与正常人肝细胞者相比差异显著(分别为P＜0.001和P＜0.01).H9101细胞染色体数为非整倍体,众数分布在52条-82条,具人类细胞染色体特征,其DNA经PCR扩增显示HBV DNA特异性条带.H9101细胞具端粒酶活性,是细胞连续传代和建系的保证;它恶性程度高、整合HBVDNA和具人肝细胞癌生物学基本特征,可为肝癌分子生物学研究提供有价值的实验材料.     

一种新型融合蛋白(RGD)3/tTF的基因表达与活性分析

为了发展一种新型的融合蛋白(RGD)3/tTF用于肿瘤血管的选择性栓塞治疗,利用PCR技术重组(RGD)3/tTF融合基因,克隆于pET22b( )载体,表达于E.coliBL21(DE3)。用镍柱纯化融合蛋白。凝血实验与FⅩ活化实验检测融合蛋白tTF组分的活性。间接ELISA分析(RGD)3/tTF与αvβ3的特异结合能力。pET22b( )/(RGD)3/tTF重组质粒成功获得并表达于E.coliBL21(DE3)。纯化蛋白(RGD)3/tTF能有效诱发血液凝固,活化FⅩ。(RGD)3/tTF与αvβ3的特异结合能力比RGD/tTF提高了32%。新型融合蛋白(RGD)3/tTF已在E.coli系统成功表达,表达蛋白保持tTF的活性并显示比RGD/tTF更高的与αvβ3的结合能力。