甲基营养菌MP688萄糖脱氢酶基因分离鉴定及性质研究

目的：鉴定甲基营养菌MP688中的葡萄糖脱氢酶基因。方法：对甲基营养菌MP688基因组序列进行比对和分析,找到与已知细菌葡萄糖脱氢酶同源性最高的基因序列mpq_2164,且该基因所编码蛋白经分析具有跨膜结构域。设计51物扩增mpq_2164和缺失跨膜区域序列的s-mpq_2164,将PCR产物克隆到表达载雄pET-15b上,在大肠杆菌BL21中完成异源重组表达,然后通过组氨酸标签镍柱亲和层析纯化,采用DCIP法测定葡萄糖脱氢酶的活力。结果：分离了甲基营养菌MP688中的葡糖糖脱氢酶基因,并实现了s-mpq_2164的高效异源重组表达;MPQ2164的氯基酸序列与已知的葡萄糖脱氢酶相似性很低,但酶活测定结果表明S-MPQ-2164具有很高的葡糖糖脱氢酶活性。结论：MPQ_2164是-个依赖于吡咯喹啉醌的葡萄糖脱氢酶,去掉跨膜结构域有利于该蛋白的异源嘉{大,     

甲基营养菌MP688胞外多糖合成的影响因素研究

目的：考察培养基组分和发酵条件对甲基营养菌MP688合成胞外多糖的影响,确定最主要的影响因素。方法：将甲基营养菌MP688接种到基础培养基中,通过改变基础培养基的氮源、培养温度、初始pH值和培养时摇床转速等条件,检测在每种条件下培养5 d后发酵液中的多糖含量,确定每种因素的最适范围;进而选取8个因素,通过Plackett-Burman实验设计12组实验,通过检测每种组合条件下的多糖产量和结果统计分析,确定影响多糖合成的最主要因素。结果：甲基营养菌合成胞外多糖的最适氮源为硝酸钠,最适温度为30-37°C,最适pH值为6.5-7.0,最适摇床转速为200-250 r/min;甲醇、硝酸钠、初始pH值和接种量是MP688合成多糖的主要影响因子。结论：运用Plack-ett-Burman实验设计筛选到甲基营养菌MP688胞外多糖合成的主要影响因子,MP688是具有多糖生产潜力的菌株。     

通过转座诱变筛选甲基营养菌吡咯喹啉醌合成缺陷突变株

目的:对电转化等Tn5转座诱变条件进行优化,获得大量甲基营养菌MP688突变株,筛选吡咯喹啉醌(PQQ)合成缺陷突变株,并对失活基因进行鉴定。方法:通过电击方法对MP688株进行Tn5转座诱变;通过检测PQQ产量,选择不产或几乎不产PQQ的突变株,用质粒拯救的方法鉴定突变基因。结果和结论:确定了MP688株电击转化的最优条件,优化了质粒拯救法鉴定突变基因的实验方案,得到了1株PQQ合成明显降低的突变株RM16,并确定了转座子在染色体上的插入位点。