苦荞类黄酮糖基转移酶FtUFGT1的重组表达与酶学性质分析

黄酮类化合物是苦荞重要的功能性成分,其糖基化修饰可改变生物体内黄酮类化合物的稳定性、可溶性及生物活性。该研究基于苦荞转录组数据并以苦荞叶片中提取的总RNA为材料,利用RT PCR克隆了苦荞类黄酮糖基转移酶(UDP glycose:flavonoidglycosyltransferase,UFGT)基因FtUFGT1,采用无缝克隆方式构建其重组表达载体并转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态,采用GST resin纯化重组表达的蛋白,采用高效液相色谱(HPLC)技术检测分析纯化后FtUFGT1的酶学性质。结果表明：(1)成功克隆的FtUFGT1编码区为1 413 bp,其编码470个氨基酸,并成功构建了FtUFGT1的重组表达载体pGEX 6p 1 FtUFGT1。(2)经转化苦荞FtUFGT1基因在大肠杆菌Rosetta(DE3)中得到可溶性的表达,并通过GST亲和层析纯化得到高纯度的苦荞FtUFGT1蛋白。(3)HPLC分析显示,以槲皮素为底物,苦荞FtUFGT1可催化异槲皮素的合成,比活力为9.174 U/mg;重组FtUFGT1的最适温度为30 ℃,最适pH为7.0,5%(V/V)的甲醇和0.5%(V/V)的Triton X 100可以显著抑制其活性。研究结果为深入揭示FtUFGT1的生物学功能及体外催化黄酮类衍生物的合成奠定了基础。     

核酸外切酶Ⅷ截短体的重组表达及其在体外DNA重组反应中的应用

核酸外切酶Ⅷ(ExonucleaseⅧ,ExoⅧ)是一种不依赖于ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶,可作为体外DNA重组反应极具应用价值的候选蛋白。目前关于ExoⅧ在体外DNA重组反应中的应用尚未有文献报道。本研究构建了保留完整外切活性的截短ExoⅧ(Truncated exonucleaseⅧ,tExoⅧ)的重组表达载体pET28a-tExoⅧ,实现了tExoⅧ在大肠杆菌中的高效表达,在纯化获得高纯度蛋白的基础上,对体外重组反应的温度、反应时间、同源臂长度等因素进行了优化分析。研究结果表明,tExoⅧ在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,每升可纯化92.40 mg tExoⅧ,比活力为1.21×10~5 U/mg;在10μL的重组体系中,2.5 U的tExoⅧ于25℃反应12.5min随后50℃保温50 min时重组效率最高。添加Pfu DNA聚合酶的体外同源臂延伸策略可以有效提高重组克隆的效率。以转化效率为2.2×10~6 CFU/μg的Mach1T1为受体细胞,对于含有21 bp同源臂的1 kb片段与5.8 kb线性化载体的重组,每微克载体可形成1.1×10~4个重组克隆,且阳性率大于80%。同源臂长度在8–21bp范围内,重组反应效率随着同源臂长度增加而提高。在最佳反应条件下,同源臂长度仅为8bp仍可实现有效的重组反应。ExoⅧ介导的体外重组体系具有酶制备方法简单、对DNA的克隆无酶切位点限制及高重组克隆效率等显著优点,是分子生物学领域具有潜在应用价值的高效基因克隆新体系。