植物细胞表面蛋白的分离和鉴定

我们发现用十二烷基硫酸钠(SDS)洗涤植物细胞,可以分离到两种蛋白。不同植物细胞的这两种蛋白,除了电泳淌度稍有不同以外,最主要的差异是量的不同。由于烟草细胞取材方便,我们对其进行了初步的分离和鉴定。SDS浸提液的紫外吸收光谱在230～240nm之间有一个肩,在260～280nm之间有一个吸收峰。Sephadex G-200凝胶过滤层析显示出两个既有茚三酮阳性反应,又含有中性糖的峰。汇集这两个峰的冼脱液进行超离心分析,结果证明是两个大分子。洗脱液经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,用考马斯亮蓝R-250和过碘酸-Schiff试剂染色,结果表明是两种糖蛋白。这两种糖蛋白用沉淀剂三氯乙酸和磷钨酸可以分开:其一是含糖量超过30％的粘蛋白,另一是含糖量不到10％的糖蛋白。氨基酸组成分析结果表明:SDS浸提的蛋白象细胞壁蛋白一样,都是富羟脯氨酸蛋白。不同的是,SDS浸提的蛋白羟脯氨酸含量超过胞壁蛋白一半以上。SDS浸提蛋白的冻干样品处观是一种有网眼结构的膜状物,磷钨酸变性后在电镜下可以观察到丝状结构。烟草细胞的SDS可浸提的蛋白含量,在细胞生长最快时显著降低。     

植物细胞表面蛋白的研究——Ⅱ.烟草细胞表面蛋白束缚二价金属离子的能力

烟草细胞表面蛋白(TCSP)能溶于稀碱(0.1NNaOH)溶液,微溶于中性盐溶液,但难溶于二价金属盐溶液中。在中性盐溶液中,pH(2—9)对其溶解度无多大影响。用乙醇和丙酮分级沉淀时,90%乙醇的得率只有58%左右,而同样浓度丙酮的得率可达70%以上。在有Mg~( )离子存在的条件下TCSP 特征光谱由270毫微米向长波方向漂移20毫微米,并在波长230毫微米处出现一个新的吸收峰。用ANS 探测结果表明,在添加Ca~( )或Mg~( )离子后,TCSP暴露的疏水链区减少。以SDS 增溶的TCSP对Mg~( )离子进行透析时,解聚的TCSP 发生重新聚合,电泳淌度也有改变。用Mg~( )离子滴定SDS 增溶的TCSP 溶液时,pH变化曲线不同于SDS 的滴定曲线。在不同离子环境中透析以降低SDS 浓度,即可形成TCSP 的聚合体,并具有不同形状。这些结果表明:TCSP 有束缚二价金属离子的能力。     

植物细胞表面蛋白的研究 Ⅲ 烟草细胞表面蛋白的组分

用有机溶剂CM、Tris-HCl缓冲(pH7.5)的生理盐水(TS)和稀碱(AS)溶液分类分离烟草细胞表面蛋白,发现含有10％左右的CM蛋白,30％左右的TS蛋白,60％左右的AS蛋白和一些未经鉴定的碱不溶性物质(AIS)。 CM蛋白的紫外吸收光谱分析,在波长260 nm附近有一吸收峰,波长320 nm处有一个肩,Sephadex LH-20亲脂性柱层析可分离出四个组分,按其光谱特性可分成两大类。TS蛋白主要是一些水解酶,已测出的有过氧化物酶,酯酶、磷酸酶和腺甙三磷酸酶。AS蛋白在Sepharose 4B柱上可分离出两个洗脱峰,SDS-10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离结果表明,主带分子量接近1.5×10~5道尔顿。 显微镜下观察TCSP及其用CM、TS和AS相继提取后的残存物形态,看到悬浮在无离子水中的TCSP表面密布黄色球形颗粒。CM提取后颗粒消失,出现比较平滑的表面。TS提取后残存物表面出现纹理结构和丝状物。AS提取后剩下的是一束束解开的纤维状物质。     

植物细胞表面蛋白的研究——Ⅳ 烟草细胞表面蛋白的盐溶性组分是部分质膜蛋白组分的外延

用EDTA和某些去垢剂在有0.15MNaCl存在的条件下提取烟草细胞表面蛋白,认为含有5％正丁醇、10 mM Tris-HC1、0.15 MNaCl和0.1mM EDTA的溶液(pH 7.5,B-TBSE)是比SDS-TBSE更为理想的溶剂。过氧化物酶、酯酶、磷酸酶和ATP酶可直接进行测定。溶液中亚丁醇和EDTA的浓度对ATP酶无明显的抑制作用。 TCSP中的盐溶性组分(TSP)可以用生理盐水直接从细胞表面洗脱。质壁分离时TSP大部分都吸附在墨表面,休克时有过氧化物酶和部分ATP酶释放出来。在高渗条件下吸附在壁表面的酶,大部分部可用1％胆酸钠增溶。除上述盐水可洗脱的酶以外,细胞壁中尚有一部分可用1％Triton X-100、1 MNaC1洗脱的和碱溶性的蛋白(ASP)结合的过氧化物酶。当细胞由对数生长期中期进入后期时,TSP的过氧化物酶活性增加而酯酶活性下降。实验表明TSP是部分质膜蛋白组分的外延。 1 mMEDTA、5 mMMgCl_2或含有1mMEDTA的5％正丁醇都不能从细胞表面洗下ATP酶。但预先用E DTA、MgCl_2或含有EDTA的正丁醇洗涤细胞,则可阻碍或促进ATP酶的分离。而且EDTA的阻碍作用可被MgCl_2抵消。