牛樟芝HMGR基因的克隆和表达分析

为研究牛樟芝(Antrodia camphorata)萜类生物合成MVA途径中关键酶3-羟-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutary CoA reductase,HMGR)的调控机制,从牛樟芝基因组中分离并克隆出AcHMGR基因,对其进行生物信息学分析、不同碳氮源添加物对该基因的诱导表达情况进行分析。分析显示:AcHMGR基因含7个外显子、6个内含子;开放阅读框为3 402 bp,编码1 133个氨基酸残基组成蛋白质序列;AcHMGR包含HMGR典型的多肽位点,即2个HMG-CoA结合基序:PLG(Ⅰ/Ⅴ)AGPLK(Ⅰ/Ⅴ)DG和AEGTLVASTSRG,2个NADP结合基序:TGDAMGMNMI和IEVGT(Ⅰ/Ⅴ)GGGT;分子系统进化分析显示,AcHMGR蛋白序列与其他多孔菌科真菌的HMGR聚为一支;表达谱分析显示:碳源中的果糖、氮源中的酪蛋白胨诱导表达AcHMGR基因的能力最强。本研究为探讨牛樟芝萜类,尤其是三萜类化合物的生物合成及调控机理提供了帮助。     

珍稀植物蒜头果野生植株结实量及果实特征研究

该研究对云南省广南县不同分布点的野生植株大小与结实量,果实、果核性状特征,果皮与果核性状间的关系进行了分析。结果表明:(1)野生成年植株个体间结实量差异大,单株结实量从几十个至几千个,变异系数可达136.38%。结实量与冠幅有正相关关系(R=0.592,P0.01),与胸径和树高无相关关系(P0.05)。(2)扁球型果实平均纵径37.10~40.36 mm,变异系数7.28%~8.65%;平均横径41.15~45.03mm,变异系数6.44%~9.31%;平均果实重量35.77~47.29 g,变异系数18.99%~21.44%。野生蒜头果果实大小差异明显,单个果实重量差别为3.4倍。(3)果核平均纵径27.50~31.69 mm,变异系数7.13%~10.99%;平均横径30.94~34.16 mm,变异系数6.47%~9.41%;平均果核重量14.03~18.77 g,变异系数17.37%~22.68%。单个果核重量差别为3.7倍。(4)平均果皮纵向厚度4.33~4.80 mm,变异系数20.22%~26.91%;平均横向厚度5.10~5.44 mm,变异系数12.92%~20.98%;平均果皮重21.62~28.51 g,变异系数20.01%~24.12%。该研究结果表明野生蒜头果单株结实量、果实和果核大小、果皮厚等表型性状存在广泛的多样性,其资源为人工定向培育和开发利用提供了较为丰富的选择材料。     

牛樟芝萜烯合成酶基因的克隆与鉴定

为了研究牛樟芝(Antrodia camphorata)倍半萜的生物合成,通过对牛樟芝基因组分析获得倍半萜类合成酶基因(AcTPS2),利用RT-PCR克隆获得其全长cDNA,对其进行生物信息学分析和表达谱分析。结果显示:AcTPS2基因cDNA全长1 068bp,Blast比对发现,AcTPS2含倍半萜类合成酶所独具的富含天冬氨酸序列DXXXD及萜类合成酶特有的RRDTSG-LDL保守序列;系统进化分析显示,AcTPS2基因与其他真菌的倍半萜聚为一类;表达谱分析显示,以甘露糖作为碳源、以酪蛋白胨作为氮源能够有效促进AcTPS2基因的诱导表达。研究结果可为以后牛樟芝倍半萜类生物合成提供一定的参考依据。     

牛樟芝非核糖体多肽合成酶基因(ＡcNRPS)的克隆与鉴定

胶霉毒素属于真菌天然次生代谢产物epipolythiodioxopiperazine (ETP)家族,具有免疫抑制剂、抗真菌等多种生物活性,是由非核糖体多肽合成酶(NRPSs)催化合成。从牛樟芝(Antrodia camphorata)基因组中挖掘出非核糖体多肽合成酶基因(AcNRPS,NCBI登录号为KX430967),克隆获取其全长cDNA,并对其进行生物信息学分析和表达谱分析。结果显示AcNRPS基因cDNA全长6 687 bp;与其DNA序列比对发现AcNRPS基因含有12 个内含子;其开放阅读框编码2 229 个氨基酸残基,BLAST比对发现其含有2 个A-C-T结构域,底物需2个氨基酸;系统发育树结果显示AcNRPS与其他合成产物为胶霉毒素的NRPS基因聚为一类,其可合成胶霉毒素类化合物;表达谱分析显示,以葡萄糖和土豆蛋白胨作为碳、氮源的培养基能够有效促进牛樟芝NRPS基因的表达。     

滇牡丹环阿屯醇合成酶基因的克隆及表达分析

为研究环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase)基因在滇牡丹生物合成中的作用机制,该文采用RT-PCR技术首次从滇牡丹(Paeonia delavayi)中克隆得到一个具完整开放阅读框的环阿屯醇合成酶基因(PdCAS),该基因全长2274 bp,共编码757个氨基酸,PdCAS蛋白序列与桃(Prunu...     

蒜头果FAD2基因的克隆与功能分析

FAD2是亚油酸合成的关键酶,是控制高油酸特性的重要基因。本研究采用RT-PCR技术在蒜头果中成功克隆得到一个FAD2基因,命名为MoFAD2,GenBank登录号为MK210593。其含有1 329 bp开放阅读框,编码442个氨基酸。序列比对分析显示MoFAD2拥有FAD2家族特有的3个保守的组氨酸中心位点,蒜头果FAD2与中粒咖啡(Coffea canephora) FAD2的蛋白序列同源性为80.00%。系统进化树分析显示MoFAD2与石榴(Punica granatum)、珙桐(Davidia involucrata)聚为一支。荧光定量PCR分析表明MoFAD2在果实和叶中均有表达,但在蒜头果果实膨大期的表达量最高。研究为将来更好地开发利用蒜头果油用价值和进一步开展FAD2在不饱和脂肪酸生物合成过程中的调控作用研究奠定基础。     

牛樟芝倍半萜合酶基因克隆及在不同培养基中的表达

牛樟芝(Antrodia camphorata)是一种珍稀食药用菌,能产生具有抗癌活性的倍半萜类化合物。对牛樟芝基因组进行分析,获得倍半萜合酶基因序列并设计特异引物,提取在Glu培养基(麦芽浸粉6 g/L,酵母提取物3 g/L,葡萄糖40 g/L)上生长的牛樟芝菌丝体的RNA,利用RT-PCR技术克隆得到倍半萜合酶基因AcTPS1。AcTPS1基因c DNA全长为969 bp,编码323个氨基酸,根据系统进化树可知AcTPS1氨基酸序列与其他9种真菌倍半萜合酶聚为一类。AcTPS1拥有典型倍半萜合酶的结构域(RRSRSATAEAYACFIW),之后检测AcTPS1在不同培养基上的菌丝中的表达结果显示不同碳源中,只有葡萄糖作为碳源时该基因表达,不同氮源中,以番茄浸粉和酪蛋白胨为氮源时该基因表达。说明AcTPS1是一类诱导型表达的基因。为利用发酵培养以及异源表达手段获得牛樟芝活性化合物提供参考。     

蒜头果中CYP71基因克隆与果实不同发育时期的表达分析

由氨基酸衍生的氰苷是由植物细胞色素P450单加氧酶(CYP)催化氨基酸生成的次生代谢产物,与植物的防御和抗逆境胁迫相关。该研究通过分析蒜头果转录组数据,从中分离并克隆得到1条细胞色素P450基因(命名为MoCYP71,GenBank登录号为MK172858),对其进行生物信息学分析并检测该基因在果实不同发育时期的表达情况。结果表明:MoCYP71基因含1 572 bp,编码523个氨基酸,该基因的cDNA序列与咖啡(Coffea eugenioides,XM_027319282)、小果咖啡(Coffea arabica,XM_027213456)中的CYP71基因的mRNA序列均有88%的一致性; MoCYP71蛋白的相对分子质量为58 976.54,理论等电点pI为8.10,分子式为C_(2675)H_(4184)N_(704)O_(744)S_(27),不稳定系数(Ⅱ)为40.84,是一种不稳定蛋白;该蛋白不存在信号肽,存在于分泌途径,含有两个跨膜结构,分别位于20～37和311～333位的氨基酸为跨膜疏水螺旋,锚定于细胞器上;该蛋白含有CYP家族的保守结构域,包括脯氨酸富集区(PPSPPRLP)、K螺旋(KETFR)、I螺旋(GGIDTS)、PERF域(PERF)和识别结构域血红素结合域(FGAGRRICPG),与可可、榴莲、高粱等的CYP71E家族的蛋白(GenBank登录号分别为EOX92908.1、XP_022773875.1和AAC39318.1)聚为一支;在花谢后,MoCYP71基因表达量逐渐降低,花谢后1个月2个月3个月,但在花谢后4个月的表达量急剧增加。以上结果对研究蒜头果的对虫害的防御、组织成熟及蒜头果中有效次生代谢产物的发掘具有重要意义。     

牛樟芝发酵液提取物抗菌活性研究

牛樟芝作为一种珍稀食用和药用菌,具有极大的开发潜力。该研究以麦芽浸粉肉汤液体培养基(BD,美国BD公司)对牛樟芝菌丝体进行摇床培养60 d后,收获发酵液并用乙酸乙酯对其进行萃取,浓缩至干获得提取物;同时,采用抑菌圈法评价培养物对13种致病细菌抗菌活性(蜡样芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、福氏志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、副溶血性弧菌、溶血性葡萄球菌、铜尿假单胞菌、乙型副伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌),并检测相应致病细菌的最低抑制浓度(MIC)。结果表明:牛樟芝麦芽浸粉肉汤发酵液提取物对供试的13种致病菌均有抑菌活性;在供试的13种致病菌中,提取物对缓慢芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、副溶血性弧菌、藤黄微球菌5种致病菌的最低抑制浓度值均小于80μg·m L~(-1),其中对藤黄微球菌的最低抑制浓度最低为66.5μg·m~(-1);随着培养时间的增加,提取物的抗菌活性也增加。这说明牛樟芝菌丝体在液体培养条件下,能够产生广谱高效抑菌活性的次生代谢产物。该研究结果为牛樟芝进一步的有效利用开发奠定了理论基础。     

蒜头果的内生真菌多样性分析

蒜头果为我国特有单种属植物,其果实富含神经酸,是一种很有开发前景的野生植物资源。为了解蒜头果中内生真菌的种类及分布情况,本研究对生长于裸露石灰岩山地和石灰岩林地两种生境的蒜头果分别取样,利用传统分离方法对蒜头果的根、树皮及叶组织中的内生真菌进行分离纯化,并依据形态学特征和r DNA-ITS序列对菌种进行鉴定。所有样品共分离获得112株内生真菌,分别属于10个属,其中紫霉属(Purpureocillium)、酵母样菌属(Acaromyces)、木霉属(Trichoderma)、淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)为优势菌种。分析显示内生真菌在不同部位差异明显,根中内生真菌分布最为普遍,两种生境条件下分离率都为100%,对比之下树皮分离率分别为56.7%和63.3%,叶的都为26.7%。不同生境对蒜头果内生真菌具有明显影响,在裸露石灰岩山地根、树皮、叶的多样性指数分别为0.756、1.518和0.662,石灰岩林地分别为1.412、1.439和0.974。在两种生境条件下,树皮的真菌多样性相似,根和叶的多样性都表现出石灰岩林地高于裸露石灰岩山地。