CDC6靶向RNA干扰质粒载体的构建及生物活性鉴定

目的:构建小鼠CDC6基因的RNAi真核表达载体PGCsilencer TM u6/Neo/GFP/RNAi,观察其转染小鼠肝细胞前后CDC6的表达变化。方法:根据GenBank中CDC6的序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至PGCsilencer U6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,用脂质体将重组子转染至正常小鼠肝细胞中,用RT-PCR检测CDC6的mRNA的表达及用Western blot方法检测CDC6蛋白水平的表达,并比较转染前后其表达水平的变化。结果:经测序,模板序列与设计序列完全正确,经过RT-PCR及Western blot方法检测,转染干扰质粒后,小鼠肝细胞中CDC6表达在mRNA及蛋白水平都有明显的下降。结论:成功构建了CDC6基因的RNAi真核表达载体并转染至小鼠肝细胞中,为下一步探讨CDC6在肝再生的作用奠定了基础。     

小鼠骨髓细胞中p16和Ralb基因启动区CpG岛的甲基化位点分析

抑癌基因p16和白血病致癌因子Ralb与白血病的发生密切相关,其启动子区CpG岛的甲基化对基因表达具有重要作用.本文旨在分析p16、Ralb基因启动子区CpG岛甲基化位点信息,并比较这两个基因在小鼠骨髓细胞和原代培养的骨髓细胞中甲基化状态的差异.运用"MethPrimer"软件预测p16、Ralb基因启动子区的CpG岛,设计甲基化特异性引物.利用重亚硫酸盐测序法(BSP)检测甲基化位点信息.结果显示,p16有1个CpG岛,岛上21个CpG位点全部未发生甲基化;Ralb有2个CpG岛,CpG岛1上的5个CpG位点全部呈甲基化状态,而CpG岛2上的17个CpG位点全部呈非甲基化状态,且小鼠骨髓细胞和体外原代培养的骨髓细胞中两基因的甲基化状态一致.表明p16、Ralb基因甲基化状态未受外界培养条件的影响而改变,提示在与两基因甲基化相关的研究中体外试验可替代体内试验.     

大鼠肝部分切除术后mTOR信号通路对肝再生的作用

目的:探讨mTOR信号通路对大鼠肝部分切除术后肝细胞蛋白质合成功能及肝细胞大小的影响。方法:采用Sprague-Dawley雄性大鼠70％肝切除模型和肝细胞分离与培养方法,在术后不同的时相点分离残肝的肝细胞,进行培养。实验分组:分离的残肝肝细胞分两组:对照组(Control组、C组)、雷帕霉素组(Rapamycin组、R组)。采用Western blot方法检测磷酸化mTOR蛋白在不同时相点的变化;采用3H-亮氨酸(3H-Leucine)掺入法测定肝细胞蛋白质合成;扫描电镜(AMRAY 1000B,US)获取肝细胞图像,病理图像分析系统(北航CM2000B)测定细胞面积。结果:1)C组中,磷酸化mTOR蛋白的含量由0h开始升高,6h达到高峰,以后即降低,而R组明显较C组含量降低;2)在术后的各时相点,C组的肝细胞的蛋白质合成率较R组显著升高(P<0．05),而且随时间点的延长,蛋白质合成率呈上升趋势;3)在2h和6h时相点C组肝细胞面积较R组显著增大(P<0．05)。但是,在C组肝细胞24h时相点面积较2h和6h减小(P<0．05)。结论:体外实验证实,肝部分切除术后mTOR信号通路即活化,促进肝细胞的蛋白质合成和细胞生长。因此,我们推测mTOR信号通路在肝再生过程中发挥重要作用。     

汶川大地震重症伤员疾病分析

目的:分析汶川大地震重症伤员的疾病种类和治疗效果.方法:选加强监护病房(ICU)重症地震伤员21例作为研究对象,比较不同疾病组患者的一般情况、血液学检查结果、急性生理及慢性健康情况评估(APACHE)Ⅱ评分和治疗效果,对部分患者行动态APACHEⅡ评分.结果:挤压伤组患者血钾浓度显著高于骨折伴并发症或者合并症组,血钙浓度显著低于单纯骨折组(P＜0.05);挤压伤组的血肌酐和天冬氡酸转氨酶(AST)浓度均高于其余各组.但差异无统计学意义(P＞0.05).两周时继续治疗组的APACHEⅡ评分显著高于转出ICU组,而血钠浓度和血钙浓度显著减低(P＜0.05);继续治疗组的血钾和血肌酐浓度明显高于转出ICU组,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论:重症地震伤员的疾病主要以骨折和挤压伤为主;血钾浓度和血肌酐浓度可初步判断病情的严重程度;对挤压伤患者在恰当时机选择截肢手术对防治挤压综合征是有效的,连续性肾脏替代治疗(CRRT)治疗是挤压综合征患者治疗的重要手段之一;动态APACHEⅡ评分在一定程度上可反映重症患者的病情变化.     

外泌体分泌在1,4-苯醌诱导的HL-60细胞凋亡中起保护作用

慢性苯暴露损害造血系统,可引起再生障碍性贫血,甚至白血病。外泌体(exosomes)是细胞分泌的纳米级膜泡,在许多生理和病理过程中发挥重要作用。然而,苯及其代谢产物对外泌体分泌的影响仍不清楚。本研究旨在观察苯的活性代谢产物1,4-苯醌(1,4-benzoquinone,1,4-BQ)能否引起人早幼粒白血病细胞HL-60外泌体分泌量的变化以及外泌体释放在1,4-BQ诱导的细胞凋亡中的作用。应用不同浓度1,4-BQ处理细胞24 h,超高速离心法提取细胞培养基中的外泌体,结果发现1,4-BQ能促进外泌体分泌,呈剂量反应关系。进一步应用外泌体抑制剂GW4869抑制外泌体分泌,流式细胞仪检测细胞凋亡率、蛋白质免疫印迹法检测抑凋亡蛋白质Bcl-2、凋亡通路关键蛋白质cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表达,探讨外泌体分泌对1,4-BQ所致细胞凋亡的影响。结果显示:与对照组相比,1,4-BQ单独处理组的凋亡率、Bcl-2、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表达均显著增高(P<0.05),而1,4-BQ+GW4869组的凋亡率及凋亡相关蛋白质的表达均显著高于1,4-BQ单独处理组(P<0.05),表明抑制外泌体分泌可增加1,4-BQ诱导的细胞凋亡。综上表明,1,4-BQ能促进外泌体分泌,并在1,4-BQ诱导的细胞凋亡中起保护作用。本研究为了解苯的毒性效应和毒性机制提供了新的实验证据。     

脐带血IGF-1浓度和DNA甲基化与巨大儿发生的相关性研究

为探究脐带血中胰岛素样生长因子Ⅰ（insulin like growth factor 1, IGF-1）的浓度和基因甲基化变化与巨大儿发生的关系,选择152名正常妊娠足月分娩的产妇和新生儿为对象,其中68名巨大儿,84名正常出生体重儿.收集产妇及新生儿的基本信息和脐带血样品. 采用双抗体夹心ABC ELISA法测定脐带血IGF-1蛋白浓度,基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术（MALDI-TOF）测定脐带血IGF-1基因启动子区CpG位点的甲基化水平. 结果显示,脐带血IGF-1启动子区CpG位点均呈低甲基化状态. 以所有研究对象出生体重的上四分位数（4 260 g）为拐点,出生体重＜4 260g组的脐带血IGF 1浓度显著高于出生体重≥4 260 g组（P=0.015）,且与出生体重呈正相关关系（r=0.242,P=0.011）. 表明在出生体重＜4 260 g范围内,脐带血IGF-1浓度的增加贡献于出生体重的增长. 但当胎儿过大时,存在负反馈调节机制,使脐带血IGF-1浓度降低,以限制胎儿过度增长. 这些结果提示,脐带血IGF-1浓度与出生体重呈双向性关联,两者均与处于低甲基化状态的脐带血IGF-1的甲基化程度无关.     

辐射诱导对犬胆管平滑肌细胞凋亡中BCL-2活性的影响

目的:探讨γ射线对BCL-2基因在犬胆管壁增殖平滑肌细胞凋亡中的活性影响。方法:实验犬24只(15～18kg),随机分为普通支架组和~(125)I支架组各12只。用切断吻合法,造成胆总管损伤。术后30天胆道狭窄形成后,分组将普通支架及125I支架从胆总管末端开口处释放到胆总管内。置入支架后60d分别行病理形态学检测,用免疫组织化学方法进行凋亡细胞,BCL-2蛋白基因检测,并用计算机图像检测系统检侧两组胆管腔面积。结果:~(125)I支架组犬胆管组织中BCL-2基因表达较普通支架组减弱,且BCL-2基因低表达组犬胆管出现明显增殖平滑肌细胞凋亡,而且犬肝外胆管无明显狭窄;而普通支架BCL-2基因高表达,且犬胆管未出现增殖平滑肌细胞明显凋亡,而且犬肝外胆管有明显狭窄。结论:~(125)I放射性支架通过抑制BCL-2基因,促进犬胆管增殖平滑肌细胞凋亡,可以抑制犬肝外胆管狭窄。