北京地区两株人偏肺病毒M蛋白基因的原核表达及抗原活性分析

人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)是最近发现的可引起人类呼吸道感染的一种副粘病毒,现被归类于偏肺病毒属(Metapneumovirus),是至今发现的第一个与人类疾病相关的偏肺病毒属成员[1]。目前已经受到世界范围的重视,已有十多个国家报道了不同年龄组人群中hMPV的感染情况。     

呼吸道合胞病毒B亚型分离株的G蛋白基因分析

对一株长春地区B亚型分离株(CC169)的G蛋白基因进行了 序列分析,结果表明：我国呼吸道合胞病毒(RSV)分离株CC169同RSV B亚型原型株CH18537的 核苷酸同源性为94%,核苷酸的有义突变率达65%。由核苷酸推导出氨基酸序列的同源性为894%,氨基酸的变异全部发生在胞外区,并主要集中在一个高度保守区的两端,胞内区和跨 膜区保守不变。氨基酸的变异导致了分离株既有糖基化位点的改变,又有蛋白长度的变异。 此外还初步探讨了我国RSV B 亚型分离株CC169的G蛋白基因同原型株之间的变异与疫苗研制 中的意义。     

近年北京人偏肺病毒基质蛋白、小疏水蛋白和粘附糖蛋白的遗传变异特征分析

为了探讨北京地区儿童中流行的人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)结构蛋白基因特征,本研究着重对hMPV北京地区地方株的基质蛋白(Matrix protein,M)、小疏水蛋白(Small hydrophobic protein,SH)和粘附蛋白(Attachment protein,G)基因进行了基因特征的分析。本研究对2006年至2010年42株hMPV的M蛋白、49株SH蛋白和55株G蛋白基因特征进行了分析,进化分析显示北京地区流行的hMPV的这3个编码蛋白基因分别属于A2、B1和B2基因亚型。地方株M基因高度保守,A和B基因型之间存在7个氨基酸位点的变异(型内高度保守)。不同基因型(A和B)和不同基因亚型(A2和B1、A2和B2)之间的SH基因的氨基酸同源性在60.7%～64.4%之间,而同一基因亚型内的氨基酸同源性则在93.3%～100%之间;同一基因型不同基因亚型之间(B1和B2)的氨基酸同源性在84.7%～88.7%之间。不同年份不同基因亚型G蛋白具有遗传多样性,使用不同的终止密码、核苷酸缺失和插入导致其核苷酸长度不同,变异程度相当高。不同基因型和不同基因亚型之间的G基因的氨基酸同源性在34.0%～38.6%之间,同一基因亚型内的氨基酸同源性在81.5%～100%之间;同一基因型不同基因亚型之间的氨基酸同源性在64.3%～69.2%之间。2008年至2010年的B2基因亚型的毒株大多数在多个位点出现了相同的氨基酸突变,同时出现了2个氨基酸的插入或重复插入,这些毒株在B2基因亚型内形成了一个新的进化簇。抗原位点预测分析显示不同基因亚型的SH和G蛋白的抗原位点均存在差异。     

微生态制剂“妈咪爱”治疗婴幼儿轮状病毒肠炎的临床研究

妈咪爱为富含乳酸菌、维生素、锌和钙的婴幼儿复方乳酸菌健肠剂。本文治疗３０例小儿急性腹泻,总有效率８０％。其中１２例粪便检测出ＨＲＶ一ＲＮＡ,１２例中显效８例,有效３例,总有效率９１．６７％。经过治疗,发热患儿７９．１７％在２４小时内退热,４８小时内全部退热。平均止泻时间为２．７３±０．９４。检测ＨＲＶ一ＲＮＡ阳性的病例,在服药后三天内有５０％转阴。对该药治疗轮状病毒肠炎的机理及优点进行了讨论。     

来自肺炎患儿的A1基因亚型人偏肺病毒全基因组序列分析

人偏肺病毒(human metapneumovirus,HMPV)是婴幼儿呼吸道感染的重要病原之一。本研究目的在于分析在HMPV监测中发现的少见型别A1基因亚型BJ-1610的全基因组序列,为HMPV的进一步研究提供数据支持。BJ-1610来源于一名患有肺炎的3月龄女婴的鼻咽洗液标本。对该毒株进行全基因组RNA分段扩增、测序、序列拼接并分析其基因组特征、变异程度及是否存在重组等现象。BJ-1610株基因组全长为13 406nt(KU821121)。BJ-1610与HMPV参考株进行全基因和各蛋白核苷酸和氨基酸序列比较,显示全基因组的核苷酸相似性范围为81.2%~98.4%,其中相似性最高的为澳大利亚株(KC562226),而SH和G基因则与其他澳大利亚株相似性更高。系统进化分析发现BJ-1610与HMPV A1基因亚型参考株位于同一分支,显示了与相似性分析相同的特征。对BJ-1610的膜表面蛋白F、SH和G蛋白序列进行分析结果显示,F蛋白最为保守,SH基因编码区的终止密码发生了突变,导致终止密码后移15位,长度由552bp变为567bp;G蛋白氨基酸序列突变较多,并导致N-糖基化位点的减少。HMPV作为儿童呼吸道疾病的重要病原之一,对其流行株基因组的分析将对其流行特征、遗传进化、致病机理、疫苗研制和抗病毒药物研发等方面的研究产生积极的推动作用。     

呼吸道合胞病毒北京地区分离株G蛋白的基因分析

从经单克隆抗体证实为Ａ亚型的北京地区呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）分离株Ｂ７９中,用ＲＴ－ＰＣＲ扩增出编码Ｇ蛋白的基因片段,克隆至载体ｐＴＺ１８Ｒ中。经核苷酸序列测定证明,我国北京地区分离的Ａ亚型株Ｂ７９与ＲＳＶＡ亚型原型株（Ａ２株）Ｇ蛋白基因的核苷酸同源性为９３．８％,核苷酸的有义突变率达６５％。由核苷酸推导出氨基酸序列的同源性为８９．６％。氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守区的两端,而胞内区和跨膜区相对保守。本文探讨了我国北京地区ＲＳＶ分离株的Ｇ蛋白基因同原型株之间的变异,在疫苗研制中的意义。     

北京地区人偏肺病毒膜表面糖蛋白G编码基因和特征的分析

为了解北京地区人偏肺病毒(hMPV)膜表面糖蛋白G编码基因的特征,提取2003年和2004年各6份hMPV阳性的临床呼吸道标本中的RNA,经用随机引物合成cDNA后,用特异性引物扩增G蛋白全基因,克隆至pBS-T载体中并进行测序。用生物软件与GenBank中hMPV的基因序列进行比较和种系进化分析。12株hMPV可以分为两个主要的进化簇1和2。每个进化簇还可以再分为不同的亚进化簇。3株(2003年)hMPV属于进化簇1;9株(3株2003年和6株2004年)hMPV属于进化簇2。这12株hMPV G蛋白基因的核苷酸长度在624~711nt,使用了两种不同的终止密码,编码的氨基酸长度为208~236 aa,蛋白质分子量为22.9~25.8kD。与进化簇2相比,进化簇1的3株hMPV都出现了3个核苷酸的缺失,但未改变读码框架。同一进化簇内的hMPV G蛋白基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.7%~100%和91.8%~100%,不同进化簇间的核苷酸和氨基酸的同源性分别为56.3%~57.4%和34.3%~38.2%。疏水性分析表明这12株hMPV G蛋白是典型的Ⅱ型跨膜锚定蛋白,分别与两个进化簇代表株的疏水图一致。这些hMPV的G蛋白氨基酸的替换集中在胞外区。它们都含有高百分比的脯氨酸(P)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T),含有相当数量的位于胞外区的O-连接糖基化位点。这些hMPV的G蛋白的N-连接糖基化位点数目和位置不尽相同。通过对G蛋白基因的分析显示,2003年和2004年北京地区流行的hMPV分属于两种不同的进化簇。基因分析显示hMPV的G蛋白是高糖基化的膜表面蛋白,具有与同属于副粘病毒科、肺病毒亚科的人呼吸道合胞病毒(hRSV)的G蛋白相似的基因特征,推测其功能和在感染免疫中的作用相当于hRSV的G蛋白,但有待进一步深入研究予以证实。     

从急性腹泻儿童中检出的人博卡病毒2型的研究

为了调查北京地区急性腹泻患儿中人博卡病毒2型（HBoV2）的流行情况并了解这一病毒的基因组特征,本研究收集2010年11月至2011年10月到首都儿科研究所附属儿童医院门诊就诊的急性腹泻患儿的粪便标本553例,采用荧光实时PCR进行HBoV2 DNA的检测。选择2例病毒载量较高的阳性标本进行HBoV2各基因片段的扩增并测序。将所测到的序列进行拼接后得到完整的基因组序列并与GenBank中的相关序列进行比较分析。结果显示,553例粪便标本中共检出HBoV2阳性标本15例,阳性率为2.7%;各年龄组中,3~6月龄患儿中的HBoV2 DNA阳性检出率最高（4.1%）;所检年度中,7月份阳性检出率最高（7.0%）;15例HBoV2检测阳性的患儿年龄均在2岁以下,其中4例患儿同时检出了诺如病毒,3例患儿同时检出了轮状病毒,1例检出了腺病毒。经测序得到两株接近完整的HBoV2基因组序列BJQ19和BJQ390;序列分析表明,这两株序列的同源性为99.2%,与GenBank中的FJ375129同源性最高,分别为99.1%和99.2%,为典型的HBoV2。上述结果表明,北京地区部分儿童的急性腹泻可能与HBoV2感染相关,且HBoV2感染在低年龄组儿童中更为常见。     

A组轮状病毒多个结构蛋白抗原表位的串联表达及其免疫原性的检测

从北京腹泻婴儿粪便提取的轮状病毒(rotavirus,RV)(T114株)的RNA中,克隆到轮状病毒结构蛋白基因vp4,vp6和vp7的全长cDNA,对它们编码的蛋白质序列和可能的抗原表位肽进行了预测,选择了RV主要抗原蛋白VP7、VP6和VP4的4个抗原表位肽,通过人工合成DNA的方式将这些抗原表位肽基因串联融合成一个阅读框RME(rotavirus multipleepitopes,RME)并构建原核表达载体.大肠杆菌表达的RME在ELISA反应中可被RV多克隆抗体识别,纯化的RME蛋白注射免疫小鼠可诱导特异性免疫应答,产生高滴度的同源氨基酸序列特异抗体和人RV抗体,其中针对RME的IgG抗体滴度达到l∶40 000,针对单个抗原表位EV7、EV6和EV4的IgG抗体滴度达l∶10 000～l∶20 000,针对RV Wa株的IgG抗体滴度较低为l∶2 500,但能特异地中和该病毒对MAC145细胞的侵染.上述结果为新型RV基因工程疫苗的研发提供了论据和基础.