HeLa细胞中Skp2的表达调控p21WAFCIP1稳定性

泛素 蛋白酶体抑制剂MG 132处理的HeLa和SaoS 2细胞中 ,低表达的p2 1WAF CIP1受泛素 蛋白酶体通路调控 .为探讨肿瘤细胞中高表达的E3连接酶底物结合亚基 Skp2和低表达的p2 1WAF CIP1之间的关系 ,在HeLa细胞中转染Skp2的反义寡核苷酸后 ,p2 1表达水平明显升高 .同时 ,相对于转染空载体和Skp2ΔF(Skp2的F box缺失突变体 )的真核表达载体 ,转染全长Skp2的HeLa细胞中 ,p2 1表达水平显著下降 ,说明肿瘤细胞中Skp2调节p2 1的稳定性 ,并且这种调控作用依赖于Skp2蛋白中的F box结构 .免疫荧光结果表明 ,Skp2和p2 1共定位于细胞核 ,这为两者间的相互作用提供了前提 ;体内相互免疫共沉淀结果表明 ,p2 1和其它SCFSkp2 的底物一样与Skp2直接结合 ,并且它们之间的结合区不在F box结构域 ,这一结果在体外的GST pulldown实验中得到验证     

Skp2参与HeLa细胞G_2/M周期检查点的调控

具癌基因特性的Skp2在大多数肿瘤组织和肿瘤细胞中异常高表达,它作为SCFSkp2复合物的底物识别亚基调控p27KIP蛋白的稳定性而促进细胞G1/S期转换.为进一步明确Skp2与G2/M周期检查点的关系,在HeLa细胞中过表达Skp2以及通过反义寡核苷酸抑制Skp2表达.结果发现:Skp2能促进细胞周期运转,表现为S期细胞增多和G2/M期细胞减少,其中F-box结构域具有重要的功能意义;反义寡核苷酸抑制Skp2表达后,HeLa细胞发生显著的G2/M期阻滞;MTT检测结果表明,400nmol/L的Skp2的反义寡核苷酸能明显抑制HeLa细胞的增殖活性;Western印迹结果表明,HeLa细胞中Skp2可能通过负调控p21WAF的稳定性来参与G2/M检查点调控,这在用放线菌素D处理HeLa细胞的实验中得到验证.这些结果初步揭示了Skp2参与HeLa细胞G2/M周期检查点调控的分子机制.     

人外周血活化淋巴细胞survivin基因的转录激活和表达相关的信号转导通路研究

Survivin是与细胞增殖和细胞凋亡调控密切相关的重要功能蛋白质,也是肿瘤临床诊断的分子标志物及治疗研究的理想靶标.由于发现人外周血活化淋巴细胞存在Survivin蛋白的显著表达,故以植物血凝素(PHA)和IL-2共刺激培养的正常人外周血单个核细胞为实验材料,采用RT-PCR、蛋白质印迹以及细胞周期分析等实验方法,观察淋巴细胞活化与Survivin蛋白表达之间的相互关系,并利用3种激酶抑制剂探索了淋巴细胞活化所致Survivin蛋白表达相关的信号转导通路.实验结果表明：人外周血单个核细胞在刺激培养36 h前后出现survivin基因的明显转录激活和蛋白质的起始表达,表达产物的水平随培养时间的延长而增加,且具有明显的细胞周期和周期时相依赖性.JAK2的抑制剂AG490阻断细胞周期的运行,且强烈抑制survivin基因的转录激活和蛋白质表达,PI3K和MEK的抑制剂Wortmannin和PD98059也有一定程度的抑制作用.所得实验结论是：survivin基因的转录激活和蛋白质表达与淋巴细胞活化相关联,代表细胞处在增殖状态.JAK2介导的JAK-STAT信号通路是淋巴细胞活化,Survivin蛋白表达必需和最重要的信号转导通路,PI3K和MEK介导的信号通路也具有一定的影响作用.