液相芯片MASA技术用于儿童呼吸道感染病原学研究

利用多靶点液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array,MASA)技术对引起儿童呼吸道感染(respiratorytract infections,RTI)的病原,包括人类呼吸道合胞病毒A型和B型(Human respiratory syncytial virus A and B,RSVA、RSVB)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、流行性感冒病毒A型和B型(Influenza A virus and Influenza B virus,INFa,INFb)、副流感病毒1型和3型(Parainfluenza virus 1 and 3,PIV1,PIV3)、衣原体(C.pneumoniae,CPN)和支原体(M.pneumomae,MPN)进行了病原学研究.我们采集并分析了140例患典型呼吸道感染症状儿童的咽拭子,发现在这些标本中至少被前述的一种病原感染的标本有95例,阳性率为67.86%.结果显示这些标本中上述病原感染的情况分别为RSVB感染的患儿占35.71%、PIV3感染的占4.29%、INFa感染的占28.57%、INFb感染的占2.14%、MPN感染的占3.57%、CPN感染的占17.86%,被两种以上病原混合感染的患儿有17.14%.这些标本中都没有检测到RSVA、PIV1和SARS-CoV病原的感染.RSVB病原的感染率在3岁以下的患儿中明显高于3岁以上的患儿,而INFa的感染情况则相反;在上呼吸道感染患儿中检测到INFa病原感染的比例明显高于下呼吸道感染,而RSVB病原感染的情况相反.此外,我们发现在2005年3月-5月中造成武汉地区儿童呼吸道感染的主要病原是以RSVB、INFa、CPN为主,而RSVB感染则又是引起儿童下呼吸道感染和引起低龄儿童呼吸道感染的重要病原.     

含外源类蜗牛毒素基因的AcMNPV的虫体感染性研究

类蜗牛毒素基因(conotoxinlike,ctl)是在一些杆状病毒基因组中存在的与蜗牛毒素类似的一类基因,其功能尚不清楚.本文利用苜蓿银纹夜蛾核多角病毒(AcMNPV)bacmid表达系统构建了含油桐尺蠖核多角体病毒(BusuNPV)ctl基因的重组病毒AcBac-ph-ctl.在细胞水平上对ctl基因的RT-PCR分析表明,该基因转录出mRNA.在甜菜夜蛾体内进行了生物活性测定,结果表明AcBac-ph-ctl与对照野生型AcMNPV的LC50,ST50无显著性差异,表明在此系统中,外源的CTL无杀虫增效性能.     

一株雀纹天蛾核型多角体病毒的鉴定及其基因组序列分析

从自然死亡的雀纹天蛾幼虫分离到一株雀纹天蛾核型多角体病毒。通过扫描及切片透射电镜发现,该病毒为单粒包埋型核型多角体病毒,命名为ThjaSNPV(Theretra japonica single nucleopolyhedrovirus)。病毒全基因组重测序后拼接显示,该病毒基因组全长134 899 bp,GC含量37.28%,与豆天蛾单粒包埋型核型多角体病毒株DZ1基因组序列相似性高达96.24%。ThjaSNPV含有131个开放阅读框（ORF）其中55个为正链基因,76个为负链基因,与宿主同为天蛾科的豆天蛾单粒包埋型核型多角体基因组相比,雀纹天蛾单粒包埋型核型多角体病毒新注释到7个基因：chitin-binding protein(ORF9),ODV-E18(ORF11),lef-11(ORF27),hypothetical protein(ORF41),lef-10(ORF42),pif-6(ORF66),P6.9(ORF88)。ThjaSNPV的DNA光裂酶基因（DNA photolyase,ORF53）中不具有豆天蛾NPV中的1bp碱基的缺失,只编码一个大的完整DNA裂合酶。3...     

HzAm1细胞rpL13基因的序列分析及病毒感染对其转录水平的影响

从美洲棉铃虫细胞(HzAM1)中克隆了核糖体大亚基蛋白L13(Ribosomal protein L13,RpL13)的cDNA及其基因组DNA序列,并进行了序列分析.其编码框为666bp,无内含子,预测编码大小约为25 kDa的蛋白.通过与其它15种动物的RpL13编码框序列进行进化分析,发现聚类结果与传统物种分类一致.转录研究表明,棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV)感染HzAm1后使rpL13在细胞内的转录水平降低,在病毒感染后96h,rpL13 mRNA的拷贝数降到对照健康细胞的8%.     

布尼亚病毒目新分类概述

布尼亚病毒目中许多病毒是新发现的, 而且对人类健康构成威胁或潜在威胁。本文结合国际病毒分类委员会(ICTV) 2017年第十次报告, 针对新列的布尼亚病毒目的最新分类系统, 总结了该类病毒 ICTV 分类的历史变化情况, 对其下属各病毒科的分类、中英文定名、代表种、病毒形态、病毒基因组结构、编码蛋白、病毒主要传播媒介、病毒感染宿主、地理分布、理化特性等进行了介绍, 并且基于病毒基因组的编码RdRp的基因序列对9个科13个属的布尼亚病毒做了系统发育分析。     

棉铃虫病毒HaSNPV fp25k基因的克隆表达及抗体制备

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV)fp25k基因的序列,设计引物,引入适当的酶切位点,利用PCR扩增出基因片段.将该基因片段克隆至原核表达镲载体pProEXHTb,经IPTG诱导,在大肠杆菌DH5α中获得了高效表达,表达产物的大小为32kDa.纯化蛋白产物免疫家兔制备抗血清.该抗血清可与原核表达的GST-FP25K融合蛋白及在感染的昆虫细胞中表达的FP25K蛋白发生特异性免疫反应.该抗体的获得为深入研究FP25K蛋白的功能提供了基础.     

感染HaSNPV棉铃虫幼虫的组织病理和免疫组化研究

本文报道了棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV)感染棉铃虫幼虫的病理时相及HaSNPV多角体蛋白在幼虫组织中表达的免疫组化研究.以5×103PFU的HaSNPV出芽病毒粒子(BV)注射4龄初的棉铃虫幼虫,石蜡切片的H.E染色表明,在感染后24h,病理变化不明显;48h后脂肪体、气管组织的细胞核开始肿大,细胞开始变形;72h后脂肪体、气管、真皮细胞核肿大十分明显,组织结构松散;但中肠和肌肉组织未见明显病变;96h后,脂肪体、气管、真皮组织结构完全被破坏,肌肉组织变疏松.免疫组化结果表明,感染后24h,未能检测到多角体蛋白在幼虫组织中的表达;感染后48h,多角体蛋白可在部分脂肪体、气管组织、血细胞和真皮组织的细胞核中表达;72h后,被感染的脂肪体、气管组织、和真皮组织的细胞数比48h多; 96h后,多角体蛋白可以在脂肪体、气管、真皮组织中大量表达,48h到96h间,被感染的血细胞数目基本不变,中肠组织和肌肉都未检测到多角体蛋白的表达;幼虫死亡后,可在中肠上皮细胞的基底膜间隙中检测到多角体蛋白的表达,肌肉组织中未见表达信号,其它组织全部被感染并且组织结构被破坏, H.E的结果与免疫组化的结果基本相符.     

表达GP64的重组HaSNPV的构建研究

杆状病毒的出芽病毒具有两类不同的膜融合蛋白, 组 I类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白GP64, 而组 II类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白F。本文以组II类型的HaSNPV为研究对象, 研究组I类病毒的GP64能否在组 II类病毒中正确表达和包装。利用 Bac to Bac系统, 构建了带有 AcMNPV膜融合蛋白 GP64 和增强型绿色荧光蛋白的重组病毒HaSNPVgp64 egfp , 同时构建了仅带有增强型绿色荧光蛋白的对照重组病毒 HaSNPVegfp , 通过对HaSNPVgp64 egfp 感染的HzAM1细胞及所产生的子代BV的Western blot检测, 证明GP64可在HzAM1中表达, 并被包装入子代BV。     

HaSNPV的9个基因的转录谱分析

使用反转录和实时荧光定量PCR技术,我们对HaSNPV的几个预期的早期基因、早晚期基因、晚期基因、极晚期基因的转录时相进行分析,结果表明:这些基因的起始转录时间与其自身的启动子类型基本是一致的。但是预期的早期基因pkip晚期才开始转录;预期的早晚期基因ha107早期不转录,仅在晚期转录。这些基因的转录水平一般都在病毒感染细胞72h后达到最高,并且极晚期基因polyhedrin的转录水平明显高于其它基因。Iap2的转录水平仅次于polyhedrin,表明它可能是一个功能基因。与AcMNPV的p10不同,在HaSNPV/HzAM1系统中p10的转录水平并不高。     

表达GP64的重组HaSNPV的构建研究

杆状病毒的出芽病毒具有两类不同的膜融合蛋白,组Ⅰ类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白GP64,而组Ⅱ类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白F.本文以组Ⅱ类型的HaSNPV为研究对象,研究组Ⅰ类病毒的GP64能否在组Ⅱ类病毒中正确表达和包装.利用Bac-to-Bac系统,构建了带有AcMNPV膜融合蛋白GP64和增强型绿色荧光蛋白的重组病毒HaSNPVgp64+egfp+,同时构建了仅带有增强型绿色荧光蛋白的对照重组病毒HaSNPVegfp+,通过对HaSNPVgp64+egfp+感染的HzAM1细胞及所产生的子代BV的Western blot检测,证明GP64可在HzAM1中表达,并被包装入子代BV.