HCV C基因在E.coli中的高效表达

本文在基因克隆和序列分析基础上,设计并构建了五种不同的HCV C基因表达工程菌株,研究了影响HCVC基因在E.coli中高效表达的因素。结果表明疏水区编码序列的存在与否对基因表达水平影响较大;翻译通读现象可直接影响目的表达产物的累积水平;不同宿主细胞对外源基因表达水平的影响也同样具有重要意义。通过试验研究,获得了高表达工程菌株,其表达水平达38.5％,为制备高质量重组HCV C抗原并研究其在疾病防治中的作用奠定了基础。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在杆状病毒载体与昆虫细胞体系中的表达

根据杆状病毒A组代表种苜蓿Y纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica Nuclear Po-lyhedrosis Virus,简称AcNPV)的分子生物学资料,我们采用分子剪裁和拼接手段,对AcNPV多角体蛋白基因加以修饰,并用人工合成定位探针,获得大约在该基因的ATG转译起始密码子一9处加有合成BamHl连接序列的转移载体质粒pAc—MV。 再与从乙肝病毒adw亚型的表面抗原基因HBng亚克隆株pYPss一1分出带有Ban·Hl粘性末端的HBsAg基因,构建表达载体质粒pAc—MV—HBsAgo经与野生型AcNPV DNA对Spodoptem 7rugJPerda细胞共转染,借助同源交换,获得插有HBsAg基因的多角体缺陷的重组病毒。根据HBsAg诊断血球凝集试验和HBs^g诊断酶标免疫测定,表明重组病毒使HBsAg基因在昆虫细胞中得到了表达,免疫电镜显示表达产物呈球状颗粒,大小约为22nm。表达产物粗制品按1μg／鼠对bal b／c鼠免疫,并于三周后强化免疫能产生抗体。由HBsAg纯样品酶标免疫法标定的标准曲线估计每升培养物的表达产物约{一8mg,细胞量为1一2×106个/ml.用重组病毒感染玉米螟4龄幼虫,也获得HBsAg基因的表达,展示了简易生产HB sag诊断试剂和疫苗的可喜前景。     

同型HCV不同分离株NS5区基因片段的比较分析

对同一地区两例输血后丙型肝炎进行ＰＣＲ分型,结果为Ⅱ型。分别将其ＮＳ５区基因部分片段克隆到ｐＵＣ１８和Ｍ１３ｍｐ１８中,序列分析结果表明在ＮＳ５区基因相同区段,二者的核苷酸同源性为８９．０４％,氨基酸同源性为９０．７５％。而且在分离株Ｖ中第７０～７２位发现阅读框内终止密码子ＴＧＡ。与Ⅱ型代表株ＨＣＶＢＫ序列相比,相同区段的核苷酸和氨基酸同源性分别为：９１．５％,９１．９２％和９１．９１％,９１．９１％。对比分析表明,在同一地区基因型相同的不同分离株间ＮＳ５区基因仍存在较大变异,分离株Ｖ可能为缺陷性病毒     

一株丙型肝炎病毒缺陷株NS5A基因片段的序列分析

Ｑ丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）引起的一种严重的传染病。丙型肝炎病毒主要通过输血和应用不洁的血液制品传播,所以利用敏感、特异的检测方法筛选献血员对丙型肝炎的预防尤为重要。现在第二代ＨＣＶ检测试剂已大批应用,加入ＮＳ５Ａ抗原的第三代试剂也正在研制中...     

质粒pMM15的构建

以pLJ3和pKO-6质粒DNA为材料,经体外重组构建了质粒pMM15。该质粒带有一个lac UV5启动子片段和一个半乳糖激酶基因。二者之间有单一的EcoRI位点。此外,还有一个Amp~1药物抗性标记。分子量约为3.8kb。该质粒在受体细胞内能够产生有活性的半乳糖激酶。在EcoRI位点插入外源DNA后,则半乳糖激酶基因表达受阻。因而在用于研究外源基因的表达及无性繁殖试验中,可通过遗传互补试验,在麦康凯半乳糖指示剂平板上,根据菌落颜色的改变来检出重组转化子。     

HCV C蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其抗原表位分析

HCV是单股正链RNA病毒,不同分离株之间其基因组序列变异较大,不同区段变异程度也各不相同,相比之下C区(核衣壳蛋白)比较保守,推测可能具有重要的生物学功能。 利用各种不同的表达系统对HCV C蛋白的研究结果表明,初步加工产物为191个氨基酸,进一步的研究表明成熟的HCV C蛋白约为120个氨基酸。我们在基因克隆和序列分析基础上研究了不同区段C基因在大肠杆菌中的高效表达,制备了重组抗原,研制了单克隆抗     

抗-丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的研制

用纯化的重组丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白100μg/0.2ml于腹腔免疫10-12周龄BALB/c鼠。在初次免疫后的第5、9和13周按初次免疫的剂量及途径进行加强免疫。第13周免疫后的第3天杀死免疫鼠,无菌操作(?)出脾脏,并分散脾细胞。