连接酶介导的诱导荧光共振能量转移法检测基因点突变

发展了一种基于连接酶介导的诱导荧光共振能量转移技术用于基因点突变的准确快速检测方法.针对特定突变位点设计的核酸探针.当与模板之间完全匹配时,被连接形成一条长的双链,双链特异性嵌入荧光染料SYBR Green I插入新生的双链区域.诱导荧光共振能量转移发生.相反,核酸探针与模板之间不匹配,则不能诱导荧光共振能量转移的出现.利用该方法,成功实现了β地中海贫血遗传病两种普遍存在的点突变Ivs-2-654(C→T)和CD17(A→T)的基因型检测.     

基于NF-κB荧光蛋白报告基因抗肿瘤药物筛选平台的建立

采用基因工程技术构建绿色荧光蛋白（GFP）报告基因质粒,有利于活细胞成像、蛋白质印迹（WB）、细胞流式分析及活细胞示踪等,从而对抗肿瘤药物进行筛选。利用聚合酶链反应（PCR）扩增NF-κB基因的启动子序列以及GFP基因片段,将其克隆到pGL6-Enhancer载体中,通过菌落PCR检测、酶切鉴定和测序证明了质粒构建成功。然后,将构建的质粒转染到HEK-293T细胞中,根据活细胞荧光成像、WB及流式细胞分析验证,构建的报告基因质粒在细胞内可正常表达。选择抗肿瘤药物雷帕霉素、紫杉醇、吉西他滨,以及本实验室正在研究开发的多肽类抗肿瘤药物M1-20、M1-21验证报告基因体系试验,发现构建的报告基因质粒可以响应药物对细胞的影响。该药物筛选平台的建立为研究抗肿瘤药物对供试细胞的影响提供了良好的试验技术体系,同时,也为构建活细胞示踪体系提供了材料。     

基于CRISPR/Cas9系统构建FOXA2表达示踪体系

利用CRISPR/Cas9系统在基因FOXA2蛋白质编码区后插入绿色荧光蛋白核酸序列,实现对FOXA2基因开启和关闭的示踪。通过靶向序列选择、Cas9靶向质粒及Donor片段的克隆、细胞转染并进行流式细胞荧光分选、阳性细胞有限稀释、富集培养及单克隆细胞的鉴定和转录翻译水平验证等5个方面,进行实验研究。在编辑的乳腺肿瘤细胞MCF-7中,绿色荧光蛋白有效表达;乳腺癌细胞内绿色荧光蛋白的表达水平同FOXA2蛋白的表达水平正相关,且经肿瘤细胞上皮间质转化进程诱导因子EGF的诱导,绿色荧光蛋白和FOXA2表达水平同步降低。方法学上CRISPR/Cas9靶向FOXA2并利用细胞内同源性定向修复插入绿色荧光蛋白序列成功;利用报告基因蛋白表达水平示踪目的基因的开启、关闭及表达量高低结果准确、方法简单,效果明显。     

穿膜肽TAT和R9的生物学效应的体内体外研究

本文比较了两种常用穿膜肽TAT和R9的体外穿膜效率、对细胞影响以及小鼠活体内不同器官的穿膜效率。非特异性穿膜肽TAT和R9分别为11个氨基酸和9个氨基酸的短肽,能够有效地穿过细胞膜进入细胞。本研究纯化制备出融合蛋白TAT-EGFP及R9-EGFP多肽,用相同浓度的活性TAT-EGFP和R9-EGFP处理肺癌细胞,观察比较二者的穿膜活性及效率;设置不同浓度梯度检测两种穿膜肽是否对细胞产生影响;通过小鼠腹腔注射TAT-EGFP和R9-EGFP活性肽段,研究二者在活体能够穿膜到达的靶位置,并比较分析二者穿膜的效果器官分布。结果显示制备获得的两种融合蛋白TAT-EGFP和R9-EGFP均能有效穿过实现穿膜功能,两种穿膜肽对乳腺癌细胞影响较小。活体试验证明两种穿膜肽在心、肝、脾、肺、肾器官均有分布,R9主要富集在小鼠的肾和肝脏中,TAT在6种被研究的器官都有富集,两种细胞穿膜肽都能透过血脑屏障到达脑部。相对来说,TAT在小鼠活体中的穿膜效果更好,荧光富集多,R9整体穿膜效果较弱。本研究分析比较了两种穿膜肽的细胞安全性浓度和活体的穿膜能力,为TAT和R9两种穿膜肽在后续试验中的合理有效的选择和使用,提供了基础数据和指导性依据。