米曲霉耐热木聚糖酶纯化及酶学特性研究

对米曲霉原始发酵液中耐热木聚糖酶进行纯化和酶学特性研究,利用甘蔗渣为碳源培养米曲霉,通过超滤和阴离子交换柱两步纯化得到木聚糖酶XynH1,分子量35．402kDa,利用飞行时间质谱和SDS—PAGE分析,推断XynH1为XylanaseXynF1,分子量为35．402kDa。XynH1属于糖苷水解酶家族10,酶活为442．2IU／nag,最适pH和温度分别为pH6．0和65℃,80℃以下及pH4．0～10．5范围内较稳定。     

酯酶产生菌株的分离筛选

利用溴甲酚紫染色法和发酵测酶活的方法,从土壤中筛选出一株酯酶高产菌株ZM1。对ZM1进行形态特征及5.8SrDNA基因两侧的内转录间隙进行序列分析推测该菌株为灰绿犁头霉(Absidia glauca Hagem)。经过紫外诱变处理,得到1株正突变株ZMM1,在适合条件下,酶活达到58.76U/mL,比出发菌株提高了104.3%。传代实验表明ZMM1具有良好的遗传稳定性。     

康氏木霉中调控纤维素酶形成的两个调控因子的克隆及功能性分析

锌指蛋白ACEI和Xyrl是里氏木霉中调控纤维素酶和木聚糖酶形成的两个调控因子,它们能竞争性结合木聚糖酶基因xynl的启动子.为进一步研究ACEI和Xyr1调控纤维素酶基因表达的机制,本研究利用PCR技术扩增康氏木霉ACEI和Xyr1 DNA结合区的基因序列,并使其在大肠杆菌中得到表达.凝胶迁移率移动试验表明ACEI和Xyrl的DNA结合区均可与纤维素酶基因cbh1启动子的287 bp序列特异性结合.提示ACEI与Xyr1不仅能竞争性结合xynl启动子,也能竞争性结合cbhl启动子.     

康氏木霉内切葡聚糖酶(EGⅠ)基因的克隆及表达

目的：构建纤维素酶EGⅠ原核表达载体,并对表达产物进行初步酶学性质研究。方法：以康氏木霉的总RNA为模板,利用RT-PCR扩增内切葡聚糖酶EGⅠ,重组到T7启动子控制下的质粒pET.His中,构建重组质粒pET.His-EGⅠ,并将其转化至E.coli BL21（DE3）plysS感受态细胞中,经0.4mmol/L的IPTG诱导表达后对其表达产物进行13%SDS-PAGE分析。结果：SDS-PAGE电泳显示EGⅠ在大肠杆菌中得到了与预期目的蛋白相一致的外源蛋白带,分子量约45kDa。初步研究表明：重组蛋白具有内切葡聚糖酶活性,最适pH为6.0,温度在30℃～40℃时酶活稳定,金属离子Mn2＋对酶活力有明显的促进作用。结论：纤维素酶EGⅠ在大肠杆菌中成功表达,具有一定活性。     

康氏木霉纤维素酶转录因子ACEII与外切纤维二糖水解酶基因 I（cbh1）启动子的结合分析

ACEI、ACEII和Xyr1是康氏木霉中调控纤维素酶基因表达的转录因子。体外实验已证实ACEI和Xyr1可与cbh1启动子上的287bp序列（-304bp~-18bp）结合从而调控cbh1基因转录,但ACEII是否可与此序列结合仍未清楚。为进一步研究ACEII调控纤维素酶基因表达的机制,利用PCR技术扩增康氏木霉ACEII DNA结合区的基因序列,并使其在大肠杆菌中表达。凝胶迁移率移动试验表明ACEII DNA结合区不能与cbh1启动子的287bp序列结合。提示了康氏木霉cbh1基因在诱导表达时起调控作用的主要是Xyr1,而不是ACEII。这对阐明真菌纤维素酶基因表达调控的分子机制具有重要的意义。     

一株杀虫抗生素产生菌的筛选、鉴定及活性物质稳定性研究

通过卤虫初步筛选及家蚕复筛,从土壤中分离得到一株产高杀虫活性物质菌株 GX-29。经16S rDNA基因序列分析表明该菌为极暗黄链霉菌。利用卤虫活性追踪对其活性物质稳定性进行初步研究,结果表明温度、紫外线对其杀虫活性影响不显著;中性及偏碱性条件下,其杀虫活性稳定。     

甘蔗糖蜜发酵生产多不饱和脂肪酸的菌种筛选

利用苏丹黑B染色和测定多不饱和脂肪酸碘值的方法,从土壤中筛选出一株适合用甘蔗糖蜜为原料生产多不饱和脂肪酸的霉菌LB1。研究表明,该菌株培养的最适糖蜜浓度为10°BX,通过单因素实验和正交实验设计,确定了优化培养条件:最适温度28℃、摇床转速为160r/min、pH值为6.0和培养天数为5d。在优化条件下,菌株的油脂含量为其生物量的57.08%,其中油脂中多不饱和脂肪酸的组成及含量为:油酸15.42%,亚油酸14.38%、γ-亚麻酸23.55%、α-亚麻酸3.06%、花生四烯酸9.87%、廿碳五烯酸8.14%、廿二碳六烯酸6.07%等。多不饱和脂肪酸的含量占总脂肪酸的80.49%。对LB1菌株进行形态特征、生理特征分析及5.8S rDNA基因两侧的内转录间隙进行序列分析推测该菌株为反屈毛霉。