流式细胞分选技术在微生物表面展示文库筛选中的应用进展

流式细胞分选技术具有测量速度快、统计学精度高、可在分析的同时把具有指定特征的细胞分选出来等特点,已广泛应用到微生物(细菌、酵母、噬菌体和杆状病毒等)表面展示文库的筛选。筛选配基的类型涵盖抗原模拟表位、特异性单链抗体或单链T细胞受体、酶变异体以及蛋白酶抑制剂等。本文对这方面的研究进展作一综述。     

人CD14基因的克隆及序列测定

采用PCR技术,从佛波酯乙醇刺激的HL-60细胞基因组DNA中扩增获得了1.1 kb的人CD14基因.序列分析表明,有四个碱基发生了突变,其中两处为首次报道.     

Ca~(2+)与细胞功能的调节

Ca~(2+)做为一种信使参与多种细胞功能的调节。本文着重从激动剂引起的Ca~(2+)动员(Ca~(2+)mobilization)方面阐述 Ca~(2+)对某些细胞反应系统的调节机理,这种调节作用对于细胞生理功能的表现有极其重要的意义。     

微生物展示技术在重金属污染生物修复中的研究进展

自然界对环境金属污染物的迁移和转化具有微秒而复杂的选择控制机理,生物修复技术以其投资少,效率高,可以原位处理低浓度有害污染物的特性而在环境治理中具有极大潜力。考虑传统的生物修复技术常常不能满足重金属治理的要求,基于重金属离子高效结合肽的微生物展示技术,有望在重金属生物修复中发挥重要作用。     

肝素结合的EGF样生长因子成熟肽的基因克隆

采用PCR方法扩增出肝素结合的EGF样生长因子(HB-EGF)成熟肽的cDNA。该cDNA用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后,回收含HB-EGF成熟肽基因长约270bP的DNA片段,插入经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切的pUC18载体中,进行序列分析。结果表明所扩增出的片段与原设计完全一致。     

蛋白激酶C对胰岛素样生长因子—1促糖代谢作用的影响

为了研究蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）在胰岛素样生长因子－１（ＩＧＦ１）促糖代谢过程中所起的作用,分别检测ＰＣＫ激动剂佛波醇酯（ＰＭＡ）和抑制剂星形孢菌素（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）对ＩＧＦ１降糖作用的影响。结果表明ＰＭＡ和星形孢菌素分别能抑和增强ＩＧＦ１的降糖作用,建立了高表达ＰＫＣα的ＨｅｐＧ２细胞株,ＩＧＦ１对此细胞株的降糖作用与对照相比大大增强,ＰＭＡ和星形孢菌素分别可大大抑制和增强ＩＧＦ１对ＰＣ     

利用IgA蛋白酶β结构域为骨架构建细菌表面展示随机肽库

以IgA蛋白酶β结构域为骨架构建细菌表面展示随机肽库。设计合成两条寡核苷酸双链,链1含有一个随机编码序列(NNK)10,其3'端可与链2互补。通过两条链的退火、延伸、酶切、回收后与酶切、去磷酸化的载体以最佳连接比连接,采用酚∶氯仿抽提去除残留的连接酶,分批进行电转化,获得一库容量为5×106的随机肽库。随机挑选10个克隆进行测序,结果显示所构建肽库的基本框架与预期设计相符,四个寡核苷酸出现的频率也与理论值相接近,表明所构建的随机肽库是成功的。     

以GST融合蛋白为靶从噬菌体肽库中筛选结合肽

以重组的谷胱甘肽S-转移酶（GST）和目标蛋白的融合蛋白为靶,通过将其固定于谷胱甘肽琼脂糖凝胶上,可以方便地从噬菌体肽库中筛选目标蛋白的结合肽.用此方法筛选到含WWXF结构的HIV-1病毒蛋白R（Vpr）的结合肽,与经典的将Vpr包被于培养板上的筛选方法相比,此方法具有简便、快速的优点.     

IGF受体1分子上IGF-1结合位点的探讨

为了探讨胰岛素样生长因子受体1(IGF-R1)分子上的胰岛素样生长因子1(IGF-1)结合位点,建立了研究IGF-1与IGF-R1相互作用的酵母双杂交模型;利用基因体外定点突变的方法,构建了7种IGF-R1突变体;然后通过报告基因活性的定量分析,在酵母双杂交模型中检测了IGF-1与各种IGF-R1突变体之间相互作用的大小,初步确定了IGF-R1分子中IGF-1的结合位点,并且IGF-R1分子上N237、T238在与IGF-1结合中起着重要作用.     

用酵母双杂交技术研究IGF-1与其结合蛋白3的相互作用

 为了探讨胰岛素样生长因子结合蛋白 3(IGFBP- 3)分子上的胰岛素样生长因子 1 (IGF- 1 )结合位点并找出其关键氨基酸残基组成 ,首先建立了研究 IGF- 1与 IGFBP- 3相互作用的酵母双杂交模型 ,可以定性和定量地分析两个蛋白质之间的相互作用大小 ;同时利用基因体外定点突变的方法 ,对推断出的 IGF- 1结合位点中的氨基酸突变 ,经 DNA序列分析 ,构建了 5种 IGFBP- 3突变体 .然后在酵母双杂交模型中通过对报告基因活性的定量分析 ,检测 IGF- 1与各种 IGFBP- 3突变体之间相互作用的大小 .结果表明 ,IGFBP- 3分子上的 Lys2 2 2 ,Gln2 2 3突变后 ,与 IGF- 1的结合力大大下降 ,而 Arg2 2 5,Pro2 2 6,Ser2 2 7突变后也导致与 IGF- 1结合力的部分下降 .从而初步确定了IGFBP- 3分子中第 2 2 2～ 2 2 7位的氨基酸区域为 IGF- 1的结合位点 ,并且 IGFBP- 3分子上 Lys2 2 2 ,Gln2 2 3在与 IGF- 1结合中起着重要作用 .