dsPAα1的缺失突变体的构建及其活性

纤溶酶原激活剂dsPAα1(Desmodusrotundussalivaryplasminogenactivatoralpha 1)从吸血蝙蝠(Desmodusrotundus)唾液中提取 ,它包括Finger、EGF、Kringle和蛋白酶区 .dsPAα1的功能可能与其分子结构相关 ,特别是其Finger区和EGF区 .构建、表达了缺失Finger和EGF区的dsPAα1的缺失突变体 (dsPK) ,研究dsPAα1的结构与功能的关系 .Western印迹检测 ,转染后细胞上清见dsPK条带 ;用小分子底物S2 76 5测定dsPAα1和dsPK的酶动力学常数 ,在无纤维蛋白存在下 ,两者的Km 和kcat Km基本一致 .但在纤维蛋白存在下 ,dsPAα1的kcat Km 值增加了 3 9倍 ,而dsPK仅增加了 1 6倍 ;溶栓试验显示dsPK具有溶栓作用 ,但溶栓作用显著低于dsPAα1;PAI 1对dsPAα1和dsPK具有同等的抑制作用 .证实dsPAα1的Finger结构区和EGF结构区对dsPAα1的纤溶功能是非常重要的     

膜型基质金属蛋白酶-1在不同内皮细胞株中的表达差异

为研究膜型基质金属蛋白酶-1（membrane-type matrix metalloproteinase-1, MT1-MMP）在血管生物学中的作用机制,比较了3株常用的内皮细胞株：人微血管内皮细胞株HMEC-1、人脐静脉内皮细胞株ECV304和EAhy926中MT1-MMP及与其功能相关的MMP-2,TIMP-2的表达差异.实时PCR 和流式细胞术检测HMEC-1、EAhy926和ECV304中MT1-MMP/MMP-2/TIMP-2的表达,明胶酶谱法分析各细胞株上清中MMP-2的酶活.实时PCR结果显示,3株细胞均表达MT1-MMP与TIMP-2,MT1-MMP在EAhy926中表达最高,TIMP-2在ECV304中表达最高,而仅在EAhy926中检测到MMP-2的表达.流式细胞术和酶谱的结果与PCR结果基本一致.MT1-MMP和MMP-2在典型的大血管内皮细胞株EAhy926中高表达可能与该细胞独特的来源、表型特点和功能有关.     

膜型基质金属蛋白酶亚家族和基质金属蛋白酶-2在人恶性造血细胞株中的表达谱及其相关性

为探讨不同恶性血液病中膜型基质金属蛋白酶（memberane-type matrix metalloproteinases, MT-MMPs）和基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）的表达差异,用半定量RT-PCR检测了13株不同谱系恶性造血细胞株中MT-MMPs和MMP-2的mRNA表达差异.明胶酶谱法分析各细胞株MMP-2的酶活,并用流式细胞术检测了MT1-MMP蛋白的表达,用SPSS10.0分析了各基因的表达与细胞来源的相关性和各基因相互间表达的相关性.结果提示,各种MT-MMPs和MMP-2在13株细胞中呈现不同的表达谱,其中MT2、MT4、MT1-MMP和MMP-2表达较广泛,而MT3、MT5、MT6-MMP在检测的细胞株中较少表达.统计分析显示,MT-MMPs和MMP-2的表达与细胞的来源无明显的相关性（P>0.1）,而MT1-MMP和MMP-2的表达有相关性（P<0.05）.同时也发现,MT3-MMP和MT5-MMP的表达有相关性（P<0.05）.MT-MMPs在恶性造血细胞中的表达差异,提示它们在不同类型的血液系统肿瘤发展中发挥各自独特的作用.另外,MT1 MMP和MMP-2,MT3-MMP和MT5-MMP之间表达的相关性提示,它们在功能上密切相关.     

人骨髓基质细胞的长期培养及其对病毒的敏感性

为了长期培养人骨髓基质细胞和研究其对病毒的敏感性,我们采用静置贴壁培养法, 体外长期培养了胎儿、儿童和成人骨髓基质细胞,并将传至5代以上的肌样骨髓基质细胞采用微量细胞病变(CPE)法,开展了对5种病毒的敏感性试验.结果表明,人骨髓基质肌样细胞对滤泡性口腔炎病毒,脊髓灰质炎病毒、I型和Ⅱ型单纯疱疹病毒均敏感,能产生明显的CPE ,其效价(TCID50)可达10-3～10-4,其中胎儿骨髓基质肌样细胞对病毒敏感性至少比儿童高2倍,比成人高4倍,即胎儿＞儿童＞成人,但对B3型柯萨奇病毒均不敏感.我们的研究结果不仅可为人骨髓基质细胞体外长期培养提供了确实可行的简便方法, 而且为该细胞对病毒的敏感性提供了实验依据,并为该细胞的利用开辟了新的应用前景.     

PCSK6对可溶性corin的活化作用研究

目的：研究前蛋白转化酶枯草溶菌素6（proprotein convertase subtilisin/kextin type 6,PCSK6）对可溶性corin的活化作用,以及PCSK6作用后的可溶性corin是否具有生物学活性。方法：以野生型corin质粒为模板,通过PCR扩增出不含跨膜区的corin基因片段,并将目的基因克隆至真核表达载体pSEC得到重组质粒pSECsolCorin,测序验证。分别将可溶性corin、PCSK6及心钠肽前体（pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP）的表达载体转染人胚胎肾（human embryonic kidney,HEK）293细胞,收取上清液。然后将可溶性corin上清液与不同体积的PCSK6上清液共同孵育,免疫印迹（Western blot）方法检测corin蛋白的活化情况。再将PCSK6作用后的可溶性corin与pro-ANP上清液共孵育,检测可溶性corin的生物学活性。结果：构建了可溶性corin的表达质粒,并在HEK293细胞成功表达可溶性corin蛋白。可溶性corin的上清液与pcsk6上清液共同孵育后可检测到活化条带,并可使pro-ANP活化为ANP。结论：PCSK6同样可以剪切活化可溶性corin蛋白,活化后的corin具有生物学活性。为可溶性corin用于心衰的临床治疗提供了重要基础。     

血管性血友病因子裂解蛋白酶的稳定表达及其活性检测

本研究旨在得到重组的血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13),进一步研究其在血栓止血中的作用。利用脂质体将编码ADAMTS13全长序列的重组质粒pSecTag-ADAMTS13转染Hela细胞,用潮霉素(Hygromycin-B)筛选得到阳性克隆细胞株,并扩大培养,收集上清。利用Ni-NTA琼脂糖柱、梯度咪唑淋洗法纯化蛋白,SDS-PAGE和Westernblotting鉴定纯化产品纯度和免疫学活性,采用GST-His双抗夹心法测定蛋白剪切活性。结果显示,成功获得一株能恒定分泌重组ADAMTS13蛋白的细胞株ADAMTS2-4,每1L培养上清可纯化得到5.8mg重组蛋白。Western blotting结果显示,ADAMTS13多抗能与重组蛋白在190kDa处显单一条带,并且蛋白具有6.4U/mL的剪切活性(每毫升正常人混合血浆中ADAMTS13活性为1U)。重组蛋白具有较好的免疫原活性和酶活性,为进一步研究ADAMTS13作用机理和运用奠定了良好的基础。