高效构建卵清白蛋白scFv噬菌体文库及其筛选

目的:建立一种高效噬菌体文库构建方法,获得抗鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)的单链抗体(scFv)噬菌体展示文库,筛选鉴定获得OVA单链抗体。方法:用OVA蛋白免疫Balb/C小鼠,选取血清抗体效价高的小鼠提取脾脏RNA,利用RT-PCR方法扩增获得小鼠重链和小鼠轻链基因。通过无缝连接酶一步将小鼠重链基因、轻链基因和linker DNA连接起来,插入噬菌体表达载体中,构建OVA scFv噬菌体展示文库。测定文库容量,对文库进行富集筛选,ELISA鉴定阳性克隆,测序后构建真核表达载体,转入Expi-CHO悬浮细胞进行真核表达,利用Western blot进行鉴定。结果:成功获得库容量为1. 2×10~7cfu的OVA scFv噬菌体展示文库,并从中筛选出8个阳性克隆,选取效价最高的2号克隆,在Expi-CHO悬浮细胞中表达获得可溶性抗体。结论:建立了一种高效构建scFv噬菌体文库的方法,筛选获得高结合活性的OVA单链抗体,并成功进行了真核表达,为OVA ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。     

靶向Glypican-3的肝癌免疫治疗研究进展

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3)蛋白高特异性表达于肝细胞肝癌患者中,研究表明其与肝癌的发展和转移关系密切。目前以Glypican-3蛋白为靶点治疗肝癌的免疫研究主要包括治疗性抗体开发、CAR-T免疫疗法、免疫毒素及多肽疫苗等。现对Glypican-3的结构功能与肝癌的关系进行介绍,并简要描述靶向Glypican-3治疗肝癌的研究现状。     

一种无血清冻存液在猪胎儿成纤维细胞上的应用研究

在猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFF)冻存过程中,血清品质常常制约着细胞的冻存效果。为了解决这个问题,本研究旨在开发一种无血清冻存液应用于猪胎儿成纤维细胞冻存。用3种不同冻存液冻存猪胎儿成纤维细胞,每种冻存10管。冻存30 d后复苏细胞,测定冻存细胞存活率,细胞增殖活力以及电转后细胞活性。结果显示:自制无血清细胞冻存液,冻存猪胎儿成纤维细胞后存活率达95.33%;细胞增殖活力以及电转后细胞活性均显著高于标准胎牛血清冻存液(p<0.05),与特级胎牛血清冻存液效果相当(p>0.05)。因此,自制冻存液冻存猪胎儿成纤维细胞效果稳定,能够替代含血清冻存液,有良好的推广应用前景。     

不同固定液对Vero E6细胞形态和染色的影响及在病毒噬斑分析中的应用

病毒噬斑形成实验是确定病毒滴度的重要方法,其中噬斑染色是非常关键的步骤,而良好的固定液不仅能够维持细胞形态,也能起到助染作用,是有效识别病毒噬斑的关键因素.为了研究不同固定液对Vero E6细胞形态和结晶紫染色效果的影响,本研究采用五种固定液对Vero E6细胞进行固定(100％甲醇、4％甲醛、10％甲醛、75％乙醇和95％乙醇).以只加PBS缓冲液的细胞作为对照组.细胞固定30 min后利用1％结晶紫进行染色.利用光学显微镜和肉眼观察细胞形态,从而评价固定和染色效果.结果 显示,10％甲醛的细胞固定效果最佳,细胞形态良好,细胞染色均匀且着色深,利用该固定剂能在病毒噬斑实验中很好的识别噬斑,是Vero E6较为理想的固定剂.     

2种腺病毒介导的eGFP对人成纤维细胞转染效率的研究

目的:比较2种不同腺病毒(adenovirus,AD)介导的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)对人皮肤成纤维细胞(Human Fibroblast,HFB)的转染效率.方法:原代分离培养人皮肤成纤维细胞并鉴定,按照感染复数MOI为10、25、50、100转染传2代的人成纤维细胞,流式细胞检测AD5-EGFP和AD5/F35-EGFP对HFB的转染效率,荧光显微镜观察转染后的荧光强度.MTT法检测AD5.EGFP和AD5/F35-EGFP对HFB的毒性.结果:两种腺病毒对HFB的转染效率随着MOI增加而增高.AD5.EGFP和AD5/F35.EGFP在MOI为10、25、50、100时转染效率分别为9.44 3.44%、31.96 11.19%、51.7 7.24%、69.99 3.26%和22.82 8.98%、55.08 2.19%、63.37 7.24%、88.63 2.58%.两种病毒在转染过程中,细胞生长正常,MTT显示各转染组与未转染组的吸光度值无统计学差异.结论:AD5/F35载体对HFB嗜性显著高于AD5.在皮肤组织的基因修饰中,AD5/F35比AD5更具优越性.     

SPF猪的培育、质量控制及其应用

无特定病原体(specific pathogen-free pig, SPF)猪是专为预防特定猪病来计划性生产的猪,对生猪生产、生命科学研究和生物制品研发等意义重大。本文综述了SPF猪的质量控制及国内外病原控制现状、病原净化方法,并简要介绍了SPF猪的应用和发展趋势。     

转基因猪研究进展

转基因猪是指运用分子生物学技术方法,将人工分离或改造过的基因整合到猪的基因组中,并能稳定的遗传给后代。转入的基因可以使猪的某些性状向人类需要的目标发生转变,因此在猪的遗传育种、以及将猪作为药物评价、疾病模型、特异性药物生产的生物反应器和组织器官移植的供体等方面具有重要的作用。就目前转基因猪的研究进展、技术方法及应用现状进行简要的综述。     

转hCTLA4-IgG基因小鼠移植皮肤在糖尿病大鼠创面存活的延 长

CTLA4-IgG是呈分泌性表达的CTLA4胞外区与人IgG恒定区的融合分子 ,可有效阻断T细胞B7-CD28共刺激信号通路,从而抑制T细胞活化、延长移 植物存活.糖尿病溃疡创面难愈合是其高致病力和高致残率的主要原因,而 及时有效的封闭创面是创面愈合的关键.异种（异体）皮肤是应用广泛的创 面覆盖物,但免疫排斥反应是移植皮肤存活的主要障碍.通过建立糖尿病大 鼠溃疡创面模型,研究表达人CTLA4-IgG蛋白的转基因小鼠皮肤在糖尿病大 鼠溃疡创面的存活及对创面愈合的影响.结果发现：糖尿病大鼠溃疡创面的 自然愈合时间显著长于正常大鼠(41.7±7.4 d vs 18.5±6.9 d, P <0.01),说明糖尿病大鼠及其溃疡模型已建立;在糖尿病大鼠创面,转 基因皮肤存活时间为22.2±5.8 d,显著长于野生型皮肤(8.2±1.8 d, P<0.01);在转基因皮肤移植后27d,糖尿病大鼠创面已完全愈合, 显著快于其自然愈合过程;在供、受体混合淋巴细胞反应（MLR）中,转基 因皮肤移植受体的淋巴细胞对供体抗原的应答能力与野生型皮肤移植受体无 显著差异.上述结果表明,移植皮肤表达人CTLA4-IgG蛋白可显著延长其在 糖尿病大鼠创面的存活时间,进而促进创面愈合,并对受体免疫系统无显著 的全身性影响     

无菌猪生长、血液以及脏器相关指标的测定

目的建立无菌太湖猪多项生理数据背景资料。方法对4头25 d无菌猪和4头同窝普通级群体,雌雄比3∶1,测定并比较血液常规、生化、免疫球蛋白和主要脏器发育指标。运用异速生长建模,对主要脏器重量相对体重的异速生长进行了分析。结果 (1)无菌猪与普通级猪的12项血常规和8项血生化指标差异有显著性(P0.05);(2)无菌猪与普通级猪的平均体重、血清中Ig M表达量差异达到显著性水平(P0.05),且无菌猪缺少肠系膜淋巴结;(3)无菌猪的心脏、脾和胃与体重呈负异速生长(异速生长指数b1),肠道与体重的异速生长指数为1.78,为正异速生长;而普通级猪的心脏、胃和肠道与体重呈负异速生长(b1),肾与体重的异速生长指数最大,为1.20,呈正异速生长。结论微生物学等级差异影响了猪体重、血液及脏器、免疫系统的发育。     

大鼠糖尿病溃疡动物模型的初步研究

目的构建大鼠糖尿病溃疡动物模型,观察评价该模型的临床及病理特点。方法利用磁片循环压迫的方法,构建大鼠糖尿病溃疡动物模型,并从整体,组织和生化三个层次对糖尿病溃疡进行了研究。结果构建出了一个可以复制的糖尿病溃疡动物模型,该模型具有组织坏死、白细胞聚集以及高浓度晚期糖化终末产物等特征。结论利用缺血再灌注法构建了大鼠糖尿病溃疡动物模型。其病理改变与人极为相似,是一种很好的用于糖尿病溃疡发病机制和治疗研究的动物模型。