酵母双杂交系统筛选与RapGAP相互作用的蛋白质

目的筛选与Rap GAP相互作用的蛋白质,为进一步研究人源Rap1GAP介导的信号转导通路、揭示其与肿瘤的关系提供实验依据。方法选用与Rap1GAP同源的来自美丽线虫的Rap GAP作为饵蛋白,以来源于美丽线虫的c DNA文库作为靶蛋白,应用p PC97、p PC86组成的酵母双杂交系统筛选c DNA文库中与Rap GAP相互作用的蛋白质。结果通过营养缺陷平板(-LTH)筛选出63个拟似阳性菌落。经过Lac Z鉴定,19个菌落为阳性,其中7个为强阳性。提取来自19个酵母菌落中的重组DNA,经PCR扩增,12个菌落出现阳性结果。将该19个重组DNA分别电转化入DH5α细菌,涂板培养后,每板挑取4~10个克隆,通过Sal I和Not I双酶切鉴定进行阳性克隆筛选。将阳性克隆的重组DNA进行序列测定。测序结果与Gen Bank比较,其中4个克隆的DNA片段为Y39b6a基因片段、2个为Rap GAP、1个为苯丙氨酸-4-羟化酶、1个为细胞色素C氧化酶,还有1个DNA片段编码美丽线虫特有的小分子蛋白的基因片段,其余11个DNA片段不编码已知蛋白质。结论初步筛选出与Rap GAP相互作用的蛋白质,特别是其中有2个克隆为Rap GAP,提示Rap GAP可能以二聚体的方式存在。     

珍奥酵母核酸对环磷酰胺致小鼠免疫功能低下的影响

目的 通过环磷酰胺致小鼠免疫功能低下,建立BALB/C小鼠免疫功能低下模型,评价珍奥酵母核酸对小鼠免疫功能低下的作用.方法 选用BALB/C小鼠,随机分组,分别给予相应的处理,选择T淋巴细胞亚群CD69+/CD3+比值、NK细胞亚群CD69+/NKG2D+比值、淋巴细胞转化率及血清IL-2含量作为细胞免疫的指标.结果 核酸各剂量组和添加剂组均可使免疫低下小鼠外周血和脾的T淋巴细胞亚群CD69+/CD3+比值、NK细胞亚群CD69+/NKG2D+比值提高,同时可提高免疫低下小鼠淋巴细胞转化率及IL-2水平,尤以高、中剂量核酸组和添加剂组明显(P＜0.05).结论 珍奥酵母核酸可以提高免疫低下小鼠的免疫功能,以其为珍奥酵母核酸的临床应用及提高机体免疫力提供了实验依据.     

HPV16 E6对HeLa细胞中Rap1GAP蛋白水平下调的研究

目的探讨HPV16E6对细胞中Rap1GAP蛋白水平的影响,为阐明宫颈癌发生发展的分子机制提供实验依据。本研究组前期实验显示,宫颈癌石蜡切片组织中Rap1GAP蛋白水平下降,且与高危型HPV16/18感染相关。本文将进一步探讨HPV16 E6是否导致Rap1GAP蛋白下调的原因。方法通过将HPV16 E6基因插入pGEX-KG的BamHI和Hind Ⅲ酶切位点构建GST标记的HPVE6质粒,采用脂质体转染法将其转染入HeLa细胞中,Westernblot方法观察GST-tagged-HPV16 E6在HeLa细胞中的表达,并观察其对HeLa细胞中内源性Rap1GAP蛋白水平的影响。结果测序表明成功构建GST标记的HPV16E6质粒;Western blot检测表明HPV16E6在HeLa细胞中成功表达;并且发现HeLa细胞中过表达HPV16 E6后,Rap1GAP蛋白相对含量(0.602±0.205)明显低于未转染组(1.130±0.163),差异具有统计学意义(P0.05)。结论HPV16 E6下调Rap1GAP蛋白水平。     

N-糖基化修饰在髓性白血病耐药中的作用

目的研究N-糖基化修饰、糖基因表达调控在髓性白血病耐药中的作用,明确N-糖基化修饰、糖基因与白血病耐药的相关性,从而为预测和诊断髓性白血病耐药性,寻求逆转药物提供新策略和靶点。方法通过修饰白血病耐药细胞株的N-糖基化（衣霉素Tunicamycin和PNGase F处理）,Western Blot检测Pgp、CD147糖蛋白的表达水平;MTT法检测N-糖基化修饰前后髓性白血病耐药细胞株的生长情况及对化疗药物的敏感性,观察上述细胞膜型N-糖基化修饰后对化疗药物耐药性的影响;进一步通过RNA干扰技术干预差异表达的糖基因,MTT法检测干扰前后白血病耐药细胞株的生长情况及对化疗药物的敏感性,观测糖基因的表达调控对髓性白血病耐药的影响。结果 NB4/ADR细胞经N-糖基化修饰后,P-gp、CD147糖蛋白的表达水平发生改变,同时该细胞的药物敏感性也增强（P〈0.05）;当通过RNA干扰技术特异性使NB4/ADR细胞中B3GNT8和ST8SIA4表达下调时,该细胞的药物敏感性增强（P〈0.05）。结论髓性白血病细胞株中N-糖基化修饰、糖基因的改变均与白血病多药耐药具有相关性,为预测和诊断髓性白血病耐药性,寻求逆转药物提供新策略和靶点。     

7岁以下儿童细菌感染耐药分析

目的观察大连地区5家医院（大连医科大学附属一院、大连医科大学附属二院、大连儿童医院、大连市第六人民医院、大连开发区医院）2012年7岁以下儿童感染病原菌分布及其耐药情况。方法临床分离菌株,采用细菌分离鉴定方法（API、VITEK、Microsean系统）进行目标细菌的鉴定,药物敏感性试验用K—B纸片扩散法测定药物的敏感性。结果共收集细菌1235株,其中革兰阴性菌725株占58．7％,革兰阳性菌510株占41．3％;分离细菌前5位依次为大肠埃希菌占14．9％、凝固酶阴性葡萄球菌占13．6％、金黄色葡萄球菌占11．7％、肺炎克雷伯菌占10．8％、铜绿假单胞菌占7．4％。结论7岁以下儿童感染致病菌对抗生素均存在不同程度耐药情况,期望在临床治疗感染时有所帮助。     

78例耐多药肺结核全程督导化疗疗效分析

目的 通过全程督导在耐多药肺结核治疗中化疗的疗效,探讨更快捷有效治愈慢性耐药结核的治疗方式.方法 选取1997年至2007年间大连市结核病医院登记的耐多药结核患者,排除糖尿病、肝肾器质性病变,及免疫系统疾病者,获得观察对象78例.采用门诊治疗全程管理,总疗程不少于22个月.结果 慢性MDR第4月痰阴转率与治愈率远低于原始MDR、继发MDR,差异有统计学意义(P＜0.05).原始MDR与继发MDR化疗效果比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 采用WHO的耐药指导原则对原发和继发耐多药结核患者开展门诊全程督导化疗,使患者的化疗方案坚持率大大增加,总治愈率达64.3％;对慢性耐多药治愈率仅为33.3％.药物耐受性差、抗结核药物肝功损害和耳毒性损害是影响规律治疗的主要原因.巩固期治疗中的阴转阳病例失败的机会大大增加,主要原因可能是难以保证患者规律治疗.开展慢性耐多药结核的特异性治疗是提高其治愈率的根本途径.     

糖基因在髓性白血病耐药性中特征性改变

目的通过研究糖基因在髓性白血病中的差异表达,明确这些糖基因与白血病耐药的相关性,从而为预测和诊断髓性白血病耐药性,寻求逆转药物提供新策略和靶点。方法采用real-time PCR技术筛选髓性白血病细胞及其耐药细胞株中差异表达的糖基因,筛选出两组细胞差异表达3倍以上的糖基因,初步探索糖基因在髓性白血病耐药性中的特征性改变;采用流式细胞仪分析髓性白血病耐药细胞株与多种FITC标记植物凝集素的结合能力,表征比较细胞膜表面糖链的特征。结果 12个糖基因在NB4和NB4/ADR细胞株中表达具有显著的差异;高表达的糖基因与FITC标记植物凝集素的结合能力增强。结论髓性白血病细胞及其耐药细胞株中糖基因、细胞膜表面糖链特征均有显著差异,这些特征性改变与白血病多药耐药具有相关性。     

活动性肺结核合并下呼吸道感染的致病菌群分析

目的 通过对活动性肺结核合并呼吸道感染的住院患者痰样检测观察,探讨肺结核住院患者下呼吸道致病菌种的分布及药物敏感情况.方法 选取大连市结核病医院1999年1月至2002年1月间住院的活动性肺结核同时合并下呼吸道感染患者164例,对患者晨起漱口后咯出气管深部痰液,置于无菌器皿内及时送检.接种于血平板和伊红美兰平板内24 h后观察,然后按细菌学特征鉴定,及进行抗菌药物体外药敏试验并列表分析.结果 本组肺结核住院患者以Gˉ菌引起的下呼吸道感染为主,占71.8％,真菌感染占28.7％,厌氧菌感染占4.6％,G+球菌占3.8％.单纯感染者59例,占36.0％;伴两种(或两种以上)细菌生长属混合感染105例,占64.0％.结论 肺结核住院患者下呼吸道致病菌种以Gˉ菌为主,真菌感染次之,感染者多为老年复治患者.分析反复发病原因,既往应用多种抗痨药物及抗生素,造成菌群失调导致二重感染.绝大多数肺结核患者营养状况差,住院时间长,极易造成院内感染.菌株检出率相对偏高,且混合感染多.     

768例肺结核患者下呼吸道感染致病菌耐药性探讨

目的探讨肺结核患者合并下呼吸道感染的致病菌及其耐药性。方法对768例确诊的肺结核患者进行痰和／或支气管肺泡灌洗液进行细菌培养。结果革兰阴性菌596株,占58．1％,对哌拉西林／舒巴坦及头孢哌N／舒巴坦耐药率在5．7％-14．3％。革兰阳性菌201株,占19．6％,对万古霉素耐药率为0。真菌228株,占22．2％,对伊曲康唑耐药,耐药率为10．6％。结论肺结核患者下呼吸道感染,以革兰阴性菌为主,真菌比例呈上升趋势。