生物基化学品分离提纯的难点和对策

由于全球面临的资源、能源、环境的压力甚至危机越来越大,利用可再生的生物质资源为原料经过物理、化学、生物及其集成方法加工化学品的研究和开发就显得越来越急迫,已经成为世界各国争相开展的重大课题①.化学品也包括生物能源,例如乙醇、甲烷等,可通过氧化反应提供大量的热能.     

多聚亚基蛋白质在固-液界面团聚的测量与表征

以血红蛋白和乙肝表面抗原(HBsAg)为模型,联用双偏振光干涉分析仪(DPI)和原子力显微镜(AFM)研究在固-液界面上的吸附行为.结果发现:当溶液环境中血红蛋白的质量浓度为1.08 mg/mL时,测得在硅羟基表面吸附的平均厚度为3.54 nm,蛋白颗粒直径达60～ 150 nm,远高于血红蛋白的分子尺寸,说明血红蛋白在固-液界面上发生团聚.当HBsAg质量浓度为0.67 mg/mL时,测得在硅羟基表面及DEAE琼脂糖表面吸附的平均厚度分别为1.06和23.69 nm,表面吸附的蛋白颗粒直径分别为288～401和520 ～ 971 nm,是单分子HBsAg尺寸的13.1～44.1倍,表明在模型蛋白表面都形成了大的团聚体.     

乳腺生物反应器表达的重组人乳清白蛋白的高效分离纯化

利用乳腺生物反应器高效地表达重组人乳清白蛋白,但是目标产物分离纯化的难度较大。通过分子模拟计算比较待分离原料中主要蛋白组分的物化性质,包括表面电势和表面疏水性,在此基础上设计了高分辨率、快速的分离纯化工艺。通过硫酸铵沉淀的正交试验条件优化,有效地去除了干扰层析精制过程的IgG杂质,提高了后续疏水层析的稳定性,从而成功地分离开目标蛋白及与其同源的牛乳清白蛋白杂质,得到纯度>95%的rHLA纯品,工艺回收率48.6%。乳糖合成活性和圆二色谱检测结果表明,纯化rHLA具有调节β-1,4-半乳糖苷转移酶活性和天然的空间结构。     

高效液相尺寸排阻色谱-多角度激光散射定量检测灭活禽流感病毒抗原中完整病毒颗粒

本研究旨在建立一种灭活禽流感病毒原料液中完整病毒颗粒准确定量的方法。针对直接采用高效液相尺寸排阻色谱法（high performance size exclusion chromatography,HPSEC）检测灭活禽流感病毒原液存在杂质干扰的问题,首先以H5N8型抗原为对象,分别考察了聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）沉淀和离子交换色谱法（ion exchange chromatography,IEC）进行预处理。在优化条件下,经DEAE FF阴离子交换层析纯化预处理,杂蛋白去除率为86.87%,病毒血凝回收率为100%。HPSEC分析预处理后的样品,8.5–10.0 min处色谱峰样品电泳检测显示主要为H5N8病毒蛋白,动态光散射分析平均粒径为127.7 nm,推测为完整病毒特征峰;在IEC预处理后的样品中加入抗体进行HPSEC检测,8.5-10.0 min处特征峰消失,显示IEC预处理有效去除了杂质干扰。通过将HPSEC与多角度激光散射技术（multi-angle laser scattering technique,MALLS）联用,可以准确获得样品中完整病毒颗粒的数量,且病毒颗粒数与色谱峰面积具有良好线性关系（R²=0.997）。建立的IEC预处理-HPSEC-MALLS检测方法应用于其他亚型（H7N9）、批次和浓度的病毒原液中完整病毒颗粒数的准确检测,均具有良好适用性,且重复性好,相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）<5%,n=3。     

聚乙二醇修饰牛血清白蛋白的反应与分析

采用N,N′-羰基二咪唑活化法活化单甲氧基聚乙二醇5000分子一端的羟基,对活化后的单甲氧基聚乙二醇分子进行了元素分析。用该活化产物对牛血清白蛋白的赖氨酸侧链氨基进行化学修饰。应用毛细管电泳对聚乙二醇修饰后的产物进行了分析,并与高效液相色谱分析结果作了对照研究,表明毛细管电泳对修饰后的牛血清白蛋白有更好的分析效果。     

一种新型的琼脂糖疏水层析介质开发及其在重组乙肝表面抗原(CHO-HBsAg)分离纯化中的应用

以粒径均一的国产高交联度快速流琼脂糖为基质,采用活化、交联等步骤合成了针对分离纯化CHO-HBsAg的3C间臂的丁基琼脂糖疏水介质,通过控制丁基配基密度提高分离HBsAg的纯化倍数和回收率,获得了纯化倍数约20、HBsAg回收率约80%的介质。评估了合成介质的理化性质,流速为500cm/h时柱压力小于0.06MPa,表明介质具有较高的机械强度和良好的流动性能,介质经过酸、碱、变性剂等处理后化学性质稳定。将介质合成工艺进一步放大到2L介质/批,应用到HBsAg分离纯化的三步层析整和工艺中,结果表明,批量合成的疏水介质,HBsAg回收率与进口介质相当,HBsAg终产品纯度在95%以上,符合国家药典要求。最后考察了介质合成批次间的配基密度的可控性和单批次合成介质的重复使用性,结果表明,合成工艺和介质的重复性能满足产业化要求,这种成本低的介质有望替代目前工业生产广泛使用的进口疏水介质。     

疫苗分离纯化研究进展

综述了国内外关于疫苗分离纯化的研究进展,系统介绍了目前可用作各类疫苗(尤其是基因工程疫苗)分离纯化的方法。沉淀和离心等传统分离技术在各类疫苗的分离纯化中应用广泛,层析技术和其它分离技术的结合已成为疫苗分离纯化的主流,新型膜技术和亲和层析在基因工程亚单位疫苗分离纯化中的作用引人注目。     

以聚乙二醇为层析伴侣同时制备SOD、过氧化氢酶和血红蛋白

发展了一条从红细胞裂解液中同时制备超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶和血红蛋白的新工艺。采用0 75 %的聚乙二醇600作为层析伴侣,使血红蛋白直接流过阴离子交换层析柱,同时吸附SOD和过氧化氢酶。经过梯度洗脱获得SOD和过氧化氢酶组分,再经过疏水性相互作用层析与凝胶过滤层析相串联,使SOD和过氧化氢酶得到纯化。纯化后的SOD和过氧化氢酶的比活力分别达到15932u/mg和65918u/mg ,血红蛋白的纯度达到99.9%以上。总回收率为:SOD ,47.4% ;过氧化氢酶,29.6% ;血红蛋白,88.7%。     

一种费氏丙酸杆菌细胞离位转化生产维生素B_(12)的方法

为建立费氏丙酸杆菌的半连续耦合发酵工艺,克服DMB对维生素B_(12)连续发酵的不利影响,考察了费氏丙酸杆菌菌体细胞离位转化合成维生素B_(12)的可行性,优化了其离位转化工艺,确定了最佳的转化时机、转化体系及DMB添加方式,具体如下:当发酵进行至84 h时,将发酵液离心,收集菌体,然后用离心上清液重悬菌体,配成5倍浓度的菌液,加入终浓度为4.5 mg/L的DMB,于30℃条件下转化48 h,维生素B_(12)的产量达到108.06 mg/L,转化效率为2.26 mg/(Lh)。     

新型蛋白质修饰剂的合成及修饰牛血红蛋白的初步研究

以L-谷氨酸和己二酸为原料合成了一种新型的四官能团蛋白质修饰剂,并用核磁共振和红外光谱对其结构进行了表征。然后以其为修饰剂,对牛血红蛋白的化学修饰进行了初步的研究,并通过高效液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳和血氧分析仪对交联牛血红蛋白的分子量和携氧性能进行了表征。结果表明,该修饰剂可以使牛血红蛋白同时在分子内和分子间发生化学交联,并较好地保持携氧能力（P50:21.7mmHg,Hill系数:2.01）,因此在众多用于开发人工血液代用品的化学修饰剂中该修饰剂具有良好的应用前景。