两株耐紫杉醇人乳腺癌细胞MCF-7的比较

建立稳定的肿瘤多药耐药(MDR)细胞株是肿瘤MDR机制研究的基础,以MCF-7细胞林为亲本细胞株,采用低浓度加量持续诱导和高浓度短期作用分别建立MCF-7/Taxola和MCF-7/Taxolb细胞模型,并对其耐药谱、动力学周期变化、表形变化、细胞侧群分布、药物蓄积等生物学特性比较评价.结果表明,MCF-7/Taxola和MCF-7/Taxolb细胞的紫杉醇(paclitaxel/Taxol)半数抑制浓度(IC50)分别是亲代MCF-7细胞的525倍和330倍,并且都对多种化疗药物交叉耐药;MCF-7/Taxola细胞S期细胞显著增加,G,期细胞减少;MCF-7/Taxolb细胞各个期变化不大;MCF-7/Taxola细胞P-糖蛋白(P-gP)、肺耐药相关蛋白(LRP)和还原型谷胱甘肽-S转移酶(GSTπ)的表达水平较亲代有显著增加,而MCF-7/Taxolb细胞GSTπ的表达水平较亲代也有显著增加,另外,拓扑异构酶Ⅱ(ToPoⅡ)在两株耐药细胞中表达都明显下降,而两株细胞雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)阳性都表达丢失;光镜下耐药细胞MCF-7/Taxola明显变大并且形态不规则而MCF-7/Taxolb变化不大;电镜下MCF-7/Taxolb表面纤绒毛成小球状隆起和絮状,而MCF-7/Taxolb表面成絮状:MCF-7/Taxola撤药10天后细胞中有紫杉醇蓄积,而MCF-7/Taxolb中没有紫杉醇蓄积.两个模型都具有MDR的基本生物学特性,可用于肿瘤MDR机制的研究,通过两种耐药细胞的比较,推测MCF-7/Taxolb细胞是MCF-7/Taxola细胞的一个亚群.     

生物素化白藜芦醇的分离纯化与药效学评价

以DCC为催化剂,采用低温化学催化法合成生物素化白藜芦醇.产物采用Resourse RPC反相色谱柱分离、纯化,并且运用液质联用进行分析验证.MTT法测定产物体外对Hep G2、MCF-7肿瘤细胞的抑制作用.实验结果显示:通过HPLC-MS、紫外扫描分析鉴定证实,分离得到的产物确实是生物素化白藜芦醇,其保留了原有的体外抗肿瘤活性.此种化学合成方法反应条件温和,容易控制,操作方便.合成得到的白藜芦醇的生物素化衍生物,为下一步探讨白藜芦醇的结合蛋白提供简单有效的分子工具.     

猪肝过氧化氢酶提取条件的研究

采用水浸提法提取猪肝过氧化氢酶。选择浸提时间、温度、料水比作为单因素进行梯度实验,确定其条件范围,再通过进一步的正交实验得到猪肝过氧化氢酶提取条件的优化组合,即料水质量比1：5,浸提温度25℃,浸提时间8h。     

合欢皮提取物抑制血管生成的体内药效学研究

为了探讨合欢皮提取物体内对血管生成的抑制作用。本文采用MTT法和Matrigel plug方法考察合欢皮提取物对人血管内皮细胞(HMEC)增殖和体内Matrigel胶小管形成的影响,运用Lewis肺癌转移小鼠模型,观察合欢皮提取物对小鼠Lewis肺癌的疗效。结果表明合欢皮提取物可明显抑制HMEC细胞的体外增殖(IC50为30μg/mL),并且呈明显的剂量依赖性,同时具有抑制Matrigel plug中的血管新生的作用。合欢皮提取物还能够明显抑制Lewis肺癌肿瘤细胞生长,减少转移病灶。提示合欢皮提取物具有明显抑制血管生成的作用,有可能成为有效的血管生成抑制剂。     

合欢皮提取物抑制血管生成作用的研究

本文采用体外细胞培养法和体内鸡胚尿囊绒膜模型、荷瘤模型检测合欢皮提取物抑制人微血管内皮细胞(HMEC-1)的增殖、迁移活性,观察合欢皮提取物的抑制血管生成情况。发现合欢皮提取物能显著抑制HMEC-1的增殖(IC50为30μg/mL)和迁移,并且呈明显的剂量依赖性。在体内同时具有抑制鸡胚尿囊膜和肿瘤组织中血管生成的作用。     

合欢皂甙Julibroside J8对人微血管内皮细胞凋亡的影响研究

本文采用体外培养人微血管内皮细胞(HMEC-1),不同浓度和时间的Julibroside J8干预,SRB法测定细胞存活率,同时结合DAPI荧光染色,TUNEL染色法检测细胞凋亡情况;Annexin-V/PI双标记行流式细胞仪测定定量观察细胞凋亡率。发现合欢皂甙Julibroside J8可显著抑制HMEC-1生长,抑制率可达75.6%,并呈时间-剂量效应关系。同时诱导细胞发生凋亡率,最高比例可达32.32%。     

改善稀有密码子和氨基酸残基限制提高重组人ADAM15去整合素结构域蛋白表达水平

[目的]为提高重组人ADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase)15去整合素结构域蛋白(rhADAMl5)的表达水平.[方法]在详尽分析rhADAM15的cDNA和GST(谷胱甘肽-S-转移酶).ADAM15结构的基础上,选择表达宿主菌并对表达质粒进行改造.[结果](1)选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA的Escherichia coli.Rosetta(DE3)作为宿主菌,将质粒pGEX-ADAM15转化于其中在最佳诱导表达条件下获得298 mg/L融合蛋白GST-ADAM15;(2)采用PCR体外定点突变技术将目标蛋白编码区稀有密码子GGA(Gly<'425)替换为GGC,使融合蛋白表达水平提高9.4%;(3)通过消除凝血酶识别序列附近的Pro-Glu-Phe残基,提高凝血酶酶切效率,使rhADAM15产量提高了35.7%;(4)在GGA替换为GGC基础上切除"Pro-Glu-Phe"残基,使rhADAM15产量提高到68 mg/L,比分别切除"Pro-Glu-Phe"残基、GGA替换为GGC和野生型提高了19.2%、51.1%和61.9%.[结论]这一结果表明,在充分认识目标蛋白特性的基础上定向选择表达宿主并改造表达质粒能实现外源蛋白高水平表达.     

白藜芦醇靶点蛋白质的研究

为探讨白藜芦醇在肿瘤细胞中的结合靶点蛋白质.采用亲和甄别磁珠法生物淘洗白藜芦醇的靶点蛋白质.在构建并优化了白藜芦醇结构模型的基础上,通过分子动力学优化分析白藜芦醇与其靶点蛋白质的结构模型,并且使用分子对接分析验证两者的结合作用.结果表明,亲和甄X别磁珠法直接筛选到的能与白藜芦醇的特异性结合的蛋白质是Myosin蛋白质和Actin蛋白质,并且成功构建得到了合理的白藜芦醇分子与Actin蛋白质的复合物的三维结构.通过分析白藜芦醇分子与Actin蛋白活性氨基酸残基结合模式发现,残基Val30,Phe31,Pro32,Thr203,Ala204,Glu205,Pro243,Asp244,等对两者的结合都有重要贡献.白藜芦醇是通过作用于肿瘤细胞的骨架结构蛋白来干扰细胞的有丝分裂过程,从而导致肿瘤细胞的体外增殖受到抑制.     

猪肝过氧化氢酶提取条件的研究

过氧化氢酶又称触酶,专一分解过氧化氢,溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚。传统方法是从牛、马或人的红细胞、肝、肾中通过选择性沉淀法、缓冲液提取法、层析法等提取过氧化氢酶。本研究以猪肝为原料对过氧化氢酶的提取条件进行了试验。根据猪肝过氧化氢酶在pH5．3—8．0有活性、最适pH为7．0、溶于水的特性,采用水浸提法提取猪肝过氧化氢酶。先选择影响提取的主要因素(浸提时间、温度、料水比)分别作为单因素进行梯度实验,确定其合适范围;再通过进一步的正交实验得到猪肝过氧化氢酶提取条件的优化组合,并综合后处理中固液分离的要求,确定最佳提取条件,即料水比15、浸提温度25℃、浸提时间8h。