家蚕五龄幼虫后部丝腺细胞EST的测定和基因表达谱分析

以C108蚕品种五龄第1天和第5天的后部丝腺为材料, 依靠EST分析探讨了有关后部丝腺细胞合成分泌丝素蛋白基因的表达调控问题. 研究结果发现, 测得的9948条EST序列, 经序列拼接分析得到2861个一致性序列, 其中, 重叠的EST群有911个, 单条序列有1950个; 被注释的一致性序列达1335个, 未被注释的一致性序列达1526个; 55.89%, 共5560条与Mita等人发表的家蚕后部丝腺细胞EST没有同源性; 五龄第1天得到的重叠的EST群数和单条序列数都要比五龄第5天的多约1倍; 重叠的EST群组成大小大于50的基因仅占所有一致性序列的0.5%左右, 基因表达的频率开差非常大, 主要表达的基因是与丝素组成和丝素分泌合成有关的基因; 五龄第5天基因表达量与第1天相比, 丝素重链基因高18倍, 丝素轻链基因高9倍, 丝素P25基因高8倍; 经功能注释分析, 被赋予担负细胞组分功能的基因达508个, 担负酶功能的基因达315个. 结果暗示了五龄第1天的基因表达除了作用于丝腺细胞的生长外, 主要是为丝素蛋白合成分泌作准备, 五龄第5天的基因表达主要是合成分泌丝素蛋白; H链、L链和P25蛋白实际可能并没有按6︰6︰1比率构成复合体, 或H链结构特殊, 不易通过EST技术检测到. 在2861个基因中将有相当部分基因参与丝素蛋白的合成与分泌, 说明家蚕后部丝腺细胞合成、分泌丝素蛋白这一生命过程比以前了解的要复杂得多.     

昆虫细胞内N-糖基化途径及人源化糖蛋白表达

虽然昆虫杆状病毒表达系统在蛋白表达领域得到了广泛的应用, 但由于不能表达复杂的末端唾液酸化的N-糖链, 使得该系统在生物制药行业的应用受到了很大的限制。通过比较哺乳动物细胞和昆虫细胞内糖基化途径可知, 其起始步骤一致, 之后再发生分化, 主要表现为3方面, 即昆虫细胞内缺乏哺乳动物细胞所具备的N-乙酰葡萄糖氨转移酶II、 半乳糖基转移酶/N-乙酰氨基半乳糖转移酶、α-2,3-唾液酸转移酶和α-2,6-唾液酸转移酶等延长N-糖链的糖基转移酶; 另外, 昆虫细胞内具有能够特异性地将蛋白质末端的N-乙酰氨基葡萄糖残基从GlcNAcMan3GlcNAc(±α3/6-Fuc)GlcNAc上切除的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶及核心α-1,3-岩藻糖基转移酶。本文从上述异同出发, 综述了克服昆虫细胞内不能表达人源化糖蛋白这一缺陷所进行的N-糖基化途径的改造研究--主要集中在昆虫细胞内GlcNAcase的抑制和昆虫细胞内GnT2, GalT/ GalNAcT, ST3及ST6等基因的导入等方面, 结果表明经改造的昆虫细胞可表达人源化糖蛋白, 这将极大地拓宽昆虫杆状病毒表达系统的应用领域。本文还探讨了选择特殊细胞系及特殊培养条件以在昆虫细胞内表达唾液酸化蛋白的可行性。