CREG活化ILK/VEGF促进内皮细胞血管新生

目的:探讨E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated gene,CREG)对血管内皮细胞血管新生的影响及其机制。方法:将重组腺病毒CREG载体(Ad-GFP-CREG)和腺病毒GFP载体(Ad-GFP)转染人血管内皮细胞株(vascularendothelialcell,VE),转染后细胞分别命名为ADCREG和ADGFP。内皮细胞基质胶血管形成实验观察其比较3组细胞血管发生情况。应用Western blotting测定细胞中CREG、整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)的表达。应用ILK激酶活性突变的质粒转染和不同浓度的VEGF中和抗体转染VE后进行细胞血管形成能力检测。结果:体内基质胶血管形成实验显示,腺病毒介导的CREG过表达显著促进VE的血管形成能力,血管密度、数量和交叉点均较对照组ADGFP和VE显著增多(P<0.01)。同时,Westernblot分析证实CREG过表达显著增加了ILK与VEGF的表达;转染ILK激酶失活质粒导致ADCREG成血管能力显著减弱(P<0.001)。应用VEGF中和抗体干预后,ADCREG细胞的成血管能力也呈现剂量依赖性下降。并且ILK激酶活性受到抑制的ADCREG细胞中VEGF表达降低。结论:CREG基因过表达通过活化ILK/VEGF信号通路促进了内皮细胞血管新生。     

体外缺血缺氧条件下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡发生的机制研究

目的:研究体外大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在缺血缺氧条件下发生凋亡的作用机制。方法:采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞(MNCs),于体外培养并由牛垂体提取物(PEX)诱导扩增传代培养出骨髓间充质干细胞(MSCs)。经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,骨髓间充质干细胞(BMSCs)在缺血缺氧条件下培养,通过Annexin V/PI双染细胞凋亡检测比较不同组别细胞的凋亡率和蛋白印迹法(western blot)来观察细胞中蛋白的变化。结果:①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示骨髓间充质干细胞培养成功。②对照组(无缺血缺氧)与缺血缺氧组比较,缺血缺氧组的凋亡率显著性增加,而通过磷酸化Akt的表达量显著性增加提示PI3K(Phosphoinosi-tide-3kinase)/Akt(ProteinkinaseB,PKB)信号通路被激活(P<0.05);同时缺血缺氧组与缺血缺氧+PI3K/Akt抑制剂(LY294002)组比较,缺血缺氧+PI3K/Akt抑制剂(LY294002)组的凋亡率显著降低,而通过磷酸化Akt的表达量显著减少提示PI3K/Akt信号通路被抑制(P<0.05)。结论:PI3K/Akt信号通路对体外缺血缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞凋亡发生有关键性作用。     

体外缺血缺氧条件下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡发生的机制研究

目的：研究体外大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）在缺血缺氧条件下发生凋亡的作用机制。方法：采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞（MNCs）,于体外培养并由牛垂体提取物（PEX）诱导扩增传代培养出骨髓间充质干细胞（MSCs）。经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,骨髓间充质干细胞（BMSCs）在缺血缺氧条件下培养,通过Annexin V／PI双染细胞凋亡检测比较不同组别细胞的凋亡率和蛋白印迹法（western blot）来观察细胞中蛋白的变化。结果：①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示骨髓间充质干细胞培养成功。②对照组（无缺血缺氧）与缺血缺氧组比较,缺血缺氧组的凋亡率显著性增加,而通过磷酸化Akt的表达量显著性增加提示PI3K（Phosphoinositide-3kinase）／Akt（ProteinkinaseB,PKB）信号通路被激活（P〈0．05）;同时缺血缺氧组与缺血缺氧＋PI3K／Akt抑制剂（LY294002）组比较,缺血缺氧＋PI3K／Akt抑制剂（LY294002）组的凋亡率显著降低,而通过磷酸化Akt的表达量显著减少提示PI3K/Akt信号通路被抑制（P〈0．05）。结论：PI3K／Akt信号通路对体外缺血缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞凋亡发生有关键性作用。     

E1A激活基因阻遏子(CREG)过表达通过抑制p38/JNK信号分子活化对抗人血管平滑肌细胞凋亡

血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡参与了动脉粥样硬化(AS)及冠状动脉介入治疗(PCI)术后再狭窄(RS)等心血管疾病的发生发展过程．E1A激活基因阻遏子(CREG)是新近发现的一种分泌型糖蛋白,在维持细胞和组织稳态方面发挥重要作用．前期研究发现CREG蛋白过表达能够对抗血清饥饿诱导的人血管平滑肌细胞(hVSMCs)凋亡,进一步探讨CREG对hVSMCs凋亡的调控作用及相关的分子机制．以逆转录病毒稳定转染的CREG过表达及表达抑制的hVSMCs为模型,应用两种药物Staurosporine (STS) 和Etoposide (VP-16) 诱导细胞发生凋亡,检测细胞凋亡和相关信号通路变化．结果显示,在药物干预后,CREG表达抑制时细胞凋亡明显增多,而CREG过表达明显抑制hVSMCs凋亡．同时也发现,CREG表达抑制时p38及JNK活性明显增强,而CREG过表达时p38和JNK活性被抑制．经腺病毒转染和药物干预抑制p38表达后,细胞凋亡均受到抑制,而且在p38活性被抑制的同时,JNK活化也受到抑制．说明p38和JNK表现为协同作用．结果也显示,VSMCs分化指标SM α-actin和SM MHC与CREG表达呈一致趋势,而细胞外基质蛋白Fibronection与CREG表达呈负相关．以上结果提示,CREG在维持VSMCs表型转换方面发挥重要作用,并且通过p38和JNK信号转导通路对hVSMCs凋亡进行调控．CREG可能对于AS和PCI术后RS的防治具有重要价值．     

胚胎干细胞SM22α-EGFP表达克隆的建立及平滑肌细胞体外发育的动态观察

为探讨血管发育早期血管平滑肌细胞(VSMCs)募集和增殖特点,构建了含有SM22α启动子序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码序列的质粒,建立了平滑肌特异性蛋白SM22α启动子控制下稳定表达EGFP的胚胎干细胞株(ESCs),以研究VSMCs的发育特点.实验发现,起源于SM22α-EGFPESCs形成的胚胎小体(EBs)在第11天开启SM22α启动子并表达EGFP.此后EGFP阳性细胞持续增加,在第30天达到高峰.VSMCs多起源于EBs中细胞密集处,应用免疫荧光染色及RT-PCR观察到EGFP阳性细胞表达多种平滑肌特异性标志物.在贴壁培养的胚胎小体中VSMCs形态可分为纺锤形及上皮样的多角形,慢速视频显微摄像测得纺锤形细胞迁移速度较上皮形细胞快.以上结果表明,SM22α-EGFPESCs分化形成的EBs可以模拟体内早期胚胎血管形成过程,从形态学上获得VSMCs募集分化的证据.     

胚胎干细胞分化形成囊状胚胎小体的形态学变化特征

目的观察胚胎干细胞R1(ESs)体外分化形成囊状胚胎小体(CEBs)及其血管内皮细胞和平滑肌细胞的时相规律和结构特点,探讨其在血管发育生物学研究中的作用和意义。方法体外悬浮培养ESs形成CEBs,采用HE染色观察CEBs的结构特点。用免疫荧光染色鉴定不同培养时间的CEBs中CASPASE-3的表达。加入全反式维甲酸(atRA)及联丁酰基cAMP(DBcAMP)定向诱导ESs分化,其后行平滑肌特异性标志物α-肌动蛋白(SMα-actin)及内皮细胞特异性标志物PECAM-1免疫荧光染色。结果典型的CEBs在第13d左右可以形成。第6d就可见CEBs中心部位出现调亡细胞,坏死腔开始形成,到第13d时中心坏死腔完全形成,凋亡细胞明显增多。将第6d的CEBs接种于培养皿后用atRA及DBcAMP处理,3d后可见SMα-actin染色阳性细胞。而未经处理的CEBs贴壁后,在第10d可见PECAM-1的表达。结论CEBs能够模拟体内血管发生形成的过程,可作为研究血管发育生物学的较好模型。     

中国汉族两个马凡综合征家系FBN1基因的一个新插入突变和一个复发点突变

目的:明确两个中国北方汉族马凡综合征(Marfan syndrome,MFS)家系的临床特点,并对其进行基因诊断。方法:对两个家系进行家系调查和系谱分析,应用聚合酶链式反应-DNA测序方法对原纤维蛋白1基因(Fibrillin-1,FBN1)的所有外显子进行测序。应用Swiss-model、Polyphen-2和SIFT软件对发现的变异位点进行功能预测。结果:两个家系均呈常染色显性遗传特点,在家系1患者中发现一个新的插入突变,即第13外显子1691位碱基处插入碱基A(1691 ins A),导致蛋白在第571位氨基酸处翻译提前终止。此外,在家系2患者中发现一个已知的点突变,即第27外显子第3463位碱基由G变为A(3463 GA),导致第1155位氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺。这两个变异位点在家系的健康人及50例健康对照中均未出现。功能预测发现这两个变异位点均可能会影响FBN1蛋白的结构或功能。结论:在两个MFS家系中发现一个新插入突变位点(1691 ins A)和一个已知点突变位点(3463 GA),为扩大FBN1基因的突变谱及进一步阐明FBN1基因突变在MFS中的作用提供理论依据。     

人参皂苷Rg1抑制大鼠急性心肌梗死后心肌纤维化

目的:观察人参皂苷Rg1对大鼠心肌梗死后心脏纤维化发生的影响。方法:通过结扎SD大鼠左冠状动脉前降支建立大鼠急性心肌梗死模型,并将40只雄性SD大鼠随机分单纯手术组与人参皂苷Rg1治疗组。治疗组的大鼠造模1 h后将预先配成药液的人参皂甙Rgl按5 rag/(kg·d)剂量腹腔注射,1/日至处死当日。对照组则腹腔注射等量生理盐水1/日至处死当日。分别于手术后1、2周时对比两组大鼠的基本生命指标,后通过马松染色对比观察各组大鼠心脏细胞形态特征以及瘢痕形成情况。结果:(1)无论是手术后1周还是2周,两组大鼠的体重、心脏重量、心重/体重、鼠尾收缩压、心率比较均没有统计学意义(P0.05);(2)无论是手术后1周后还是2周后,人参皂苷Rg1治疗组心脏瘢痕形成要明显少于对照组。结论:人参皂苷Rg1能够有效抑制大鼠急性心肌梗后心脏纤维化的发生。     

成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞分离及培养的优化方案

目的:摸索及优选成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的实验方法。方法:将成年SD大鼠心脏剪成小组织块,采用以下四种方案(A:0.08%胰酶+0.1%胶原酶II消化15 min,B:0.2%胶原酶II消化15 min,C:0.2%胶原酶II消化60min,D:0.2%胶原酶II消化90 min)提取成年大鼠心脏原代成纤维细胞,再通过差速贴壁分离方法培养原代成纤维细胞。采用倒置显微镜观察成纤维细胞的基本形态特征,并进行Vimentiin免疫荧光染色对培养的原代细胞进行荧光鉴定;采用台盼兰染色对培养的原代成纤维细胞存活率进行鉴定;采用细胞计数对培养的成纤维细胞生长趋势进行鉴定。结果:四种方法均能培养成纤维细胞,但单酶消化60 min可一次性提取较多细胞,并且细胞状态佳,3 d即可传代。72 h成纤维细胞Vimentin免疫荧光染色阳性率高达97%。台盼兰染色可见其细胞死亡率明显降低,并且细胞计数可见细胞生长状态极佳。结论:单酶消化60 min是提取成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的高效、快速、稳定的实验方法,为心脏疾病的基础及临床研究提供了较为理想的细胞学实验模型。     

人参皂苷Rg1通过缺氧诱导因子1α促进血管内皮生长因子旁分泌

目的：研究人参中提取的小分子活性物质皂苷Rg1能否促进大鼠骨髓间充质干细胞（marrow—derived mesenchymal stem cells,MSCs）分泌血管内皮生长因子,并进一步探究其作用机制与缺氧诱导因子1α（Hypoxia—induciblefactor,HIF-1）的相关性。方法：用酶联免疫吸附剂测定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）观察细胞培养上清中的血管内皮生长因子（vascularen—dothelial growth factor,VEGF）以及蛋白印迹法（western blot）观察细胞中缺氧诱导因子相关蛋白的变化。结果：①通过对照组与人参皂苷Rgl处理组比较发现,1小时前血管内皮生长因子的分泌在两组之间没有明显差异,而在1小时后人参皂苷Rg1处理组相比较于对照组的血管内皮生长因子分泌显著性增加;②进一步实验发现人参皂苷Rgl处理的骨髓问充质干细胞中的HIF—1α在1小时后明显增加,而HIF-1β没有随时间有明显变化。结论：人参皂苷Rgl具有促进骨髓间充质干细胞分泌VEGF的功能,并且发现HIF-1α在这一过程中发挥关键作用,为将来人参皂苷Rgl在临床中的广泛应用提供了重要的理论依据。