腈水合酶基因克隆与调控表达的研究进展

微生物腈水合酶作为新型生物催化剂得到日益广泛的应用 ,但野生菌株本身存在的酶稳定性差等问题制约了这一绿色工艺的发展 ,基因工程菌为解决这个难题开辟了新的思路。总结了各种菌株中腈水合酶的序列研究进展 ,虽然基因序列和蛋白序列同源性不高 ,但它们都以基因簇的形式存在 ,并具有相同的活性中心序列。归纳了克隆并表达腈水合酶基因的基本步骤和方式 ,并提出几种有效增强重组腈水合酶活性表达的方法。     

产腈水合酶重组大肠杆菌的质粒稳定性研究

成功构建了腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)高表达的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETNH^M(Kan^r),研究了重组质粒pETNH^M在重组菌株中的质粒稳定性。结果表明,pETNH^M具有较好的结构稳定性,连续传代60代后质粒的基因序列没有明显缺失,且能够正常表达腈水合酶。pETNH^M具有分离不稳定性,在无抗生素选择压力下,连续传代48代后质粒丢失的无质粒细胞开始出现。琼脂糖凝胶电泳定量分析表明,2/3的质粒pETNH^M以二聚体形式存在,导致质粒拷贝数的下降。进一步研究表明,重组细胞的连续高速分裂及腈水合酶的高表达也会造成质粒拷贝数的下降,从而降低其分离稳定性。反之,重组菌株相对于宿主菌株的较高比生长速率有利于保持含质粒细胞的生长优势,卡那霉素的选择压力则能够保证质粒的稳定遗传。