巨噬细胞免疫调变信号——Raf-1,MAPK,cPLA2的激活和IL-12分泌的研究

LPS介导的小鼠腹腔巨噬细胞免疫调变的信号和机理是不清楚的.应用LPS和PMA处理抑制性巨噬细胞后,发现Ras下游信号分子Raf-1,MAPK和cPLA₂均被活化,包括Raf-1的磷酸化,MAPK p44和p42磷酸化以及cPLA_2的活化,使花生四烯酸的释放显著增加,结合新近发现的LPS、PMA能诱导抑制性巨噬细胞PKC-α和PKC-ε同工酶的激活与转位,认为在LPS介导的免疫调变中,PKC信号通路的活化及其与Raf-1/MAPK通路的“连接”是主要信号传导通路.同时调变巨噬细胞也能分泌IL-12.     

巨噬细胞免疫调变信号:Raf-1,MAPK p44,MAPK p42和p38 MAPK的研究

为了了解巨噬细胞免疫调变机理,我们应用LPS和PMA处理小鼠抑制性巨噬细胞,观察到Ras下游信号分子Raf-1,分裂原激活蛋白激酶MAPK p44,MAPK p42和p38 MAPK均被活化,发现forskolin能增强p38 MAPK的活性,进一步提示PKC和PKA途径增强了p38 MAPK的磷酸化效应,为我们了解LPS如何激活p38 MAPK信号通路提供了一个新的机会。     

λDNA限制片段上的基因在大肠杆菌中表达

我们用EcoR1及BamH1两种限制性核酸内切酶来酶解质环pBR322成为pB-R322C(375bp)及pBR322B(3987bp),并酶解λcI857S_7DNA 的EcoR1限制片段λF_2(λDNA 的65.5—81%片段)成为λF_2A(λDNA 的65.6—71.3%片段,2679bp)及λF_2B(λDNA 的71.3—81%片段,4559bp)。再用T_4-DNA 连接酶将pBR322B 及λF_2B重组成为一个新质环,叫做pCB_2,其上具有cI 基因,cro 基因及启动基因,这是从随机挑取的338个菌落的第48号菌所携带的新质环。pCB_2的性质是:1.它赋予转化子以单抗药性(Ap~r),2.它赋予转化子对λcI857S_7感染的免疫性,由此可见,我们接上去的λ启动基因在发挥作用,cI 基因或/和cro 基因得以表达。第48号菌经过42℃处理后,其免疫能力仍不低于处理前的。3.经EcoR1或BamH1一种酶水解后,用电镜及凝胶电泳检查,测得pCB_2的分子长度为2.66±0.33μm,分子量为5.51±0.68×10~6d(计算值为5.41×10~6d,8546bp)。4.经过EcoR1及BamH1二种酶水解后,分解为二种分子,一大一小。在凝胶电泳中,其分子量大的与λF_2B 相当,小的与pBR322B 相当。5.pCB_2具有生物活性,其转化频率为2.1×10~6CFU/μgDNA。6.用λF_2与经历EcoR1切割成线状的pCB_2在一起进行变性后复性,在电镜下观察异源双链图形,其长度与建造时的设计相符。从以上结果我们得出的结论是:我们建造的PCB_2是一个新质环,其中的CI 基因及/或cro 基因,能在λ启动基因指导下,在大肠杆菌中表达。     

~λDNA与其EcoR1酶切片段的同源双链以及与~λplac 5 DNA的异源双链

用硷性蛋白膜甲酰胺铺展开法对DNA分子进行电镜制样,拍摄了线状双链λDNA和其ECOR 1酶切片段的电镜照片,并测得它们的长度。λDNA与其三个EcoR 1酶切片段的同源双链分子是以1:22克分子比例制得的,三个同源双链分子的双链长度分别与F_1、F_3、F_4片段的长度相同,两端均为单链。λDNA与λplac5 DNA的异源双链分子总长度与λDNA大致相同,单链环位于分子的41.5—47.2%之间。     

在ADH1转录终止子区存在逆向复制叉移动的阻抑点

双向电泳定位复制叉技术是定位复制起点及分析复制叉移动过程的有力手段.用该技术分析了从酵母V号染色体克隆的pBY8-ARS在质粒上的复制起始功能 同时,构建了一个质粒模型包含ADH1启动子,终止子及βhCG-cDNA的转录单位,用双向电泳分析该转录单位逆向复制叉移动的情况. 首次证明,除rDNA以外,结构基因的终止区也存在逆向移动的复制叉的阻抑点,这为转录对逆向复制叉的移动具有阻抑作用的普遍性提供了证据.     

E.coli外切核酸酶Ⅲ的提取和纯化

E.coli外切核酸酶Ⅲ(EXOⅢ)有四种功能。第一,从双链DNA 3’端向5’端逐个水解磷酸二酯键,释放出5’-单核苷酸,因此是3’→5’的外切核酸酶。第二,水解DNA的3’末端磷酸单酯键,释放出无机磷酸。第三,它可以在DNA无嘌呤区段上水解磷酸二酯键,因而又是无嘌呤或无嘧啶内切核酸酶。最后,对