小肽在原核和真核细胞中抑制α-synuclein异常折叠的研究

目的:研究在大肠杆菌中能够有效抑制α-synuclein异常折叠的小肽,在人神经母细胞瘤SH-SY5Y中的抑制作用.方法:基于α-Syn疏水区域设计的5种透膜小肽在大肠杆菌中能够有效抑制α-synuclein异常折叠;构建真核表达质粒CMV-SynGFP-IRES-Pn并转入SH-SY5Y细胞,通过测定细胞荧光强度分析小肽抑制α-synuclein异常折叠情况,由此评价大肠杆菌筛选系统确定的小肽在真核SH-SY5Y细胞中的有效性.结果:在大肠杆菌中能有效抑制α-Syn(129A)异常折叠的三种小肽R7P1、R7P3、R7P4,在SH-SY5Y中的作用效果也十分明显,分别比对照肽ASIlD提高了114%、98%和98%.对于α-Syn(53T),R7P1和R7P2在SH-SY5Y中分别比对照提高了90%和44%;然而在两种细胞中,5种透膜小肽对野生型α-Syn(WT)的作用与对照相比差距不明显.     

Hsp提高细菌的逆境生存能力和乙醇产量

目的：用热休克蛋白Hsp（HeatShockProteins）基因重组大肠杆菌,改善细胞生长状况、提高大肠杆菌的逆境耐受性和乙醇产量。方法：将来自Pyrococcus加诬凇的基因Hsp与Lac启动子串联,构建成由Lae启动子调控Hsp表达的操纵子,经该操纵子转化的大肠杆菌分别在高渗透压、酸性条件、高温和高糖的条件下发酵,利用气相色谱检测发酵液中的乙醇含量。结果：含有Hsp基因的工程菌与不含Hsp基因的对照菌相比,在0．4mol／LNaCl的高渗透压下乙醇产量提高1．5倍、在pH4．5的酸性条件下提高1．2倍、在高温高糖的条件下提高5．95倍。结论：热休克蛋白Hsp基因的表达可以提高大肠杆菌在逆境中的代谢能力。     

热休克蛋白增加大肠杆菌抗逆性和乙醇产量的研究

目的：研究热休克蛋白对增加大肠杆菌抗逆性和乙醇产量的影响。方法：运用基因工程技术,用大肠杆菌的Lac启动子、运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因（pdc）和乙醇脱氢酶基因（adhB）,构建可以在大肠杆菌中表达的Lac-AP操纵子。Lac-AP操纵子导入大肠杆菌,可使大肠杆菌发酵糖生产乙醇。再用来自超嗜热菌强烈火球菌（Pyrococcus furiosus）的小分子热休克蛋基因（sHsp）,构建在大肠杆菌中表达的Lac-APH操纵子。结果：成功地构建了耐高温产生乙醇的大肠杆菌LAPH和LAP,它们发酵后乙醇的产量分别为11.5g/L、7.9g/L,而对照菌LH的产量只有为0.5g/L。与对照菌LH相比,LAPH和LAP的产量分别提高了23倍和15.8倍。结果证明：与对照LAP相比,热休克蛋白使菌种LAPH的45℃温度耐受性提高15.75倍、50℃温度耐受性提高40.7倍,乙醇的产量增高高达4.74倍。结论：研究表明,小分子热休克蛋白的表达,可使细菌在致死温度下的存活率显著提高,耐受温度明显增强,乙醇产量显著提高。     

代谢工程改造运动发酵单胞菌用于提高乙醇产量

目的:采用可以在运动发酵单胞菌中表达的操纵子构建重组运动发酵单胞菌,用于提高该细菌对高温高糖的耐受性和提高乙醇产量.方法:用外来的YfdZ、MetB和Hsp构建的多顺反子质粒,转化运动发酵单胞菌而使其获得新的代谢途径.在玉米水解液中,验证了该多顺反子质粒对运动发酵单胞菌产生乙醇的影响.结果:与对照菌相比,在37℃和糖浓度为28%的培养条件下,该基因工程菌的乙醇产量提高到183.2%.在37℃,糖浓度为28%并添加氮源的条件下,该基因工程菌的乙醇产量提高到148.0%.结论:YfdZ、MetB及Hsp三种基因的共同作用能显著提高运动发酵单胞菌的乙醇产量和发酵温度.     

蟑螂浓核病毒(pfDNV)非结构基因启动子的活性研究

为了研究蟑螂 Periplaneta fuliginosa 浓核病毒(pfDNV)非结构基因转录调控的机制,用 PCR 的方法从蟑螂浓核病毒基因组 DNA 中扩增了非结构蛋白基因 ns3 翻译起始密码子上游 325 bp 的启动子序列;并进一步以其作为模板,利用聚合酶链式反应技术,得到 6 个不同长度的启动子片段和两个定点突变体片段,构建由其驱动的萤火虫荧光素酶基因报告质粒,在 脂质体介导下转染多种昆虫细胞,体外分析了该启动子的活性。结果表明：该 325 bp DNA 片段在 Sf9,S2,Tn368 及 Ld652 细胞中均具有较高的启动子活性;其转录起始基序 CAGT 对维持该启动子的基本转录活性而言是必需的,而 TATA 盒对此则是非必需的,但它的存在可显著提高启动子的转录活性。同时,我们还发现,病毒非结构蛋白 NS1 对该启动子具有反式激活作用,并且这种激活作用的大小取决于 NS1 蛋白在细胞中的浓度。     

大肠杆菌中透膜小肽抑制α-Synuclein聚集的研究

目的:在大肠杆菌中研究透膜小肽抑制α-Synuclein(A53T,S129A,WT)的异常聚集.方法:基于α-Syn核心区的疏水区域设计了5种包含7个精氨酸的多聚精氨酸多肽膜透过传输系统的小肽R7P1～R7P5;构建融合蛋白α-Syn-GFP,其中α-Syn基因融合于GFP上游,透膜小肽以双顺反子方式与α-Syn-GFP共表达;以文献报道的可抑制α-Syn异常聚集的小肽ASI1D(MRRGGAVVTG(R)6)为对照,通过监测整体细胞荧光强度研究透膜小肽影响α-Syn(A53T,S129A,WT)的异常聚集的情况.结果:5种小肽能不同程度的抑制α-Syn(A53T,S129A,WT)的异常聚集;和对照Pc相比,R7P4抑制α-Syn(A53T)异常聚集的效果提高了55%,R7P3抑制α-Syn(S129A)异常聚集的效果提高了64%,R7P4抑制α-Syn(WT)异常聚集的效果提高了39%.结论:在大肠杆菌中,透膜小肽可以有效地抑制α-Syn(A53T,S129A,WT)的异常聚集.     

5型腺病毒E1A基因通过调控GP73的表达抑制肝癌细胞增殖的初步研究

目的:研究5型腺病毒(Ad5)E1A基因通过调控高尔基蛋白73(GP73)的表达水平,抑制肝癌细胞Hep G2的增殖。方法:以腺病毒为模板、pc DNA-flag-Vector为载体,构建真核表达载体pc DNA3-Flag-Ad5E1A;免疫印迹实验鉴定重组蛋白Ad5E1A的表达;免疫印迹实验验证Ad5E1A对GP73表达水平的影响;将Ad5E1A基因转染Hep G2细胞,用CCK-8试剂盒检测Hep G2细胞的增殖情况。结果:免疫印迹实验结果证实,真核表达载体pc DNA3-FlagAd5E1A在HEK293细胞中得到表达;Ad5E1A可明显抑制GP73的表达。酶标仪检测发现,与转染Flag-GP73组相比,Ad5E1A组的抑制率为17.5%,差异无统计学意义(P0.05);而与转染Flag-GP73组比,共转Ad5E1A和GP73组的抑制率为37.8%,差异有统计学意义(P0.05)。结论:Ad5E1A基因通过调控GP73的表达抑制了肝癌细胞Hep G2的增殖。为研究肝癌发生机制,开发新型治疗方案提供了实验基础。     

响应面法优化重组工程菌的发酵工艺条件

目的：对基因改造运动发酵单胞菌的发酵工艺条件进行优化,提高重组菌发酵乙醇产量。方法：使用分子克隆实验操作技术构建重组运动发酵单胞菌,以单因素实验为基础,利用Box-Behnken中心组合实验和响应面分析法,确定了影响重组菌高产乙醇的三个重要因素。结果：成功构建含有YfdZ、MetB基因和Hsp基因的重组菌Zymomonas mobilis HYM,发酵主要影响因素的最佳条件分别为温度28℃,葡萄糖浓度24%（W/V）,pH7.4。在此优化条件下,Zymomonas mobilis HYM的乙醇产量可高达105.0735g/l,比原始菌株乙醇产量提高16.4%。结论：用中心组合设计和响应面分析法优化重组运动发酵单胞菌的发酵工艺条件,显著提高乙醇产量。     

人酸性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用Ncol Ⅰ和EcoRI双酶酶切,获得人酸性成纤维细胞生长因子haFGF基因,将该基因片断连接进入pBV220的EcoRI位点。连接物转化入大肠杆菌RR1,用菌落原位杂交的方法筛选出杂交阳性菌株,用酶切和Southern Blot的方法确定haFGF的插入与否以及插入方向的正反,结果我们得到了haFGF正向插入在pBV220 PLPR启动子下游的重组质粒pBV-αFGF。42℃热诱导使重组子表达,其菌体的裂解液对3T3细胞的DNA合成有较强的促进作用,说明重组菌株能够表达具有生物活性的hαFGF。SDS-PAGE结果表明,hαFGF表达产物约占菌体总蛋白的15％。hαFGF表达产物以包涵体的形式存在。