果蝇心脏发育标记基因Lbe抗体的制备与应用

黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的心脏发育调控基因与人类的相关基因具有高度同源性.Lbe基因是果蝇心脏发育的重要调控基因.为了深入研究Lbe基因在心脏发育中的调控功能,采用DNA免疫技术制备了抗果蝇Lbe蛋白的多克隆抗体.通过PCR扩增Lbe基因序列,将该序列与真核表达载体pCAGGS-P7同...     

斑马鱼心脏发育候选基因Pygo1多克隆抗体的制备及检测

Pygo1是心脏发育候选基因,可能在斑马鱼心脏发育过程中起着重要的调控作用.利用生物信息学选择斑马鱼Pygo1基因抗原亲水区,将扩增出的PCR片段克隆到原核表达pGEMT-4T-1载体中,转入E.coli中后通过IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactoside)分别诱导表达GST融合蛋白.蛋白经纯化分离后用于免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.用Western Blot检测抗体的效价和特异性.     

果蝇心脏发育标记基因Hand多克隆抗体的制备

制备果蝇心脏标记基因Hand抗体对研究果蝇心脏发育具有重要意义。从果蝇体内提取出总RNA,反转录得到果蝇的cDNA,将其作为模板PCR得到Hand基因部分片段,将片段连接到pET-28a上,构建重组质粒pET一28a—Hand,将重组质粒转化rosetta受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化,SDS—PAGE电泳分析,结果表明Hand基因在大肠杆菌中成功表达,表达的Hand融合蛋白分子量大约为24kD,经镍柱纯化后获得了高纯度可溶性的Hand蛋白。     

斑马鱼基因ATF4多克隆抗体的制备

ATF4是含有bZIP结构域的ATF／CREB转录因子家族成员,对胚胎的发育以及细胞的增殖、分化有重要的调节作用。制备ATF4的多克隆抗体对于研究其在斑马鱼心脏发育过程中的作用有重要的意义。研究首先通过生物信息学方法,选择ATF4基因中特异性强、具亲水性的一段核苷酸序列（1017bp）,通过PCR扩增,将片段重组到原核表达载体pET-28a,然后转化入Rosetta菌株中。经测序鉴定正确后,用IPTG诱导表达融合蛋白,以该融合蛋白免疫小鼠,获得ATF4多克隆抗鼠血清。对该多抗血清抗体进行验证,具有很好特异性和较高效价,可以用作Western—blotting、免疫印迹等试验分析。     

斑马鱼心脏标志基因TNC多克隆抗体的制备及表达研究

TNC是心脏发育的标志基因,但该基因在斑马鱼中的表达尚未研究。斑马鱼TNC基因基因的开放阅读框含有5132bp,编码1710个氨基酸,采用生物信息学结合PCR的方法获得了斑马鱼TNC基因的片段。将所得的PCR片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并将重组质粒（pGEX-4T-1-TNC）转化大肠杆菌BL21;通过IPTG诱导表达GST—TNC融合蛋白,通过尿素洗涤沉淀蛋白并切胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。Western blot和免疫组化分析表明,制备的抗体具有良好的高效价性和特异性。利用该抗体进行斑马鱼胚胎抗体染色分析表明,TNC蛋白在心脏组织中特异表达。     

利用DNA免疫技术制备WNT16蛋白多克隆抗体

Wnt16属于非经典wnt信号途径上的一员,目前有大量的研究表明wnt16与胚胎的血液发育和骨骼发育相关。为了阐明wnt16在造血过程中的调控机制,利用RT-PCR(逆转录PCR)扩增斑马鱼wnt16基因的ORF(开放阅读框)序列全长,构建真核表达载体pCAGGS-P7/wnt16,测序正确后,用该表达载体免疫BALB/c雌鼠,进行DNA免疫,制备斑马鱼抗WNT16特异性多克隆抗体。结果表明:通过DNA免疫制备的斑马鱼抗WNT16抗血清能特异性识别WNT16蛋白。斑马鱼WNT16抗体成功制备为进一步的功能研究奠定了重要基础。     

果蝇心脏发育标记基因Kruppel的多克隆抗体制备

Kruppel在果蝇发育过程中起着重要的调控作用。为了进一步研究Kruppel的功能,需要制备Kruppel蛋白及其抗体.对已有的Kruppel序列进行分析,选取适当区域进行引物设计,从果蝇心脏cDNA文库中PCR扩增得到Kruppel部分编码区序列,并其连接到pET-28a载体上。将重组质粒（pET-28a-Kruppel）转化rosetta受体菌,通过IPTG（Isopropylβ-D-thiogalactoside）诱导表达融合蛋白,用镍柱进行亲和纯化。将纯化得到的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体的效价。     

Nodal蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

斑马鱼心脏发育模型中Nodal编码转录因子调节心脏的左右不对称发育,为了进一步研究Nodal信号途径在心脏发育中的调控作用和心脏疾病发生的分子机制,需要获得斑马鱼Nodal蛋白并制备其抗体.采用从斑马鱼心脏组织中提取RNA,通过反转录得到心脏组织各种表达基因的cDNA为模板,PCR扩增得到Nodal部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达.经酶切及测序鉴定后,转化Rosseta细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体.获得了Nodal原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Nodal多克隆抗体,为Nodal功能的进一步研究奠定了基础.     

果蝇Domeless蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究

在果蝇(Drosophila melanogaster)的研究中发现Domeless接受器参与发育期间的JAK/STAT信号调节,在心脏疾病的发生机制中发挥重要作用.为了克隆Domeless,我们利用生物信息学选择果蝇Domeless基因抗原亲水区,将扩增出的PCR片段克隆到原核表达pET-28a载体中,转入E.coli(Escherichia coli)中后通过IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactoside)诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-Domeless融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.用Western blot检测抗体的效价和特异性.获得了Domeless原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Domeless多克隆抗体,为后续Domeless功能研究奠定了基础.     

小鼠RMND5A的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

RMNDSA通过MAPK信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程.通过PCR扩增RMND5A基因,并将其克隆至表达载体pGEX-4T-1上,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,再通过IPTG进行诱导表达GST-RMND5A融合蛋白.通过尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,Western blot检测抗体活性.结果说明,获得了RMND5A原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗RMND5A多克隆抗体,为RMND5A进一步的功能研究奠定了基础.