一种高效的单质粒模式四环素诱导表达系统的构建

现有的四环素诱导调控系统基于两个单独的质粒分别表达反式结合蛋白和外源基因.其缺点是在建立转基因定量表达动物模型时,需要制备和维持两个动物品系,再进行杂交才有可能获得双转基因后代,步骤繁琐,难度较大.针对上述缺陷,本研究尝试将反式蛋白rtTA表达框和低背景响应元件Ptight组装到同一个载体上,构建为严谨型单载体模式的诱导表达系统pTRE-Tight-rtTA,并通过两种报告基因的表达对其调控活性进行了研究.含有荧光素酶和绿色荧光蛋白的pTRE-Tight-rtTA-Luc和pTRE-Tight-rtTA-EGFP报告载体分别转染猪肾PK15细胞并经强力霉素处理,均可成功诱导报告基因的定量表达.在等摩尔转染条件下,单载体系统的诱导效率明显高于双载体系统（Dox-1 000 ng,10 倍;Dox-10 000 ng,8 倍）.该诱导型单载体系统的成功构建为外源基因的定量表达提供了新手段,为转基因定量表达动物模型的研究提供了新策略.     

用Cre/LoxP和CRISPR基因工程技术构建猪肌肉生长抑制素双等位基因敲除细胞系

肌肉生长抑制素 (myostatin,Mstn)基因失活可引起哺乳动物的肌肉增生,但其调控机制尚不清楚,且缺乏可靠的试验材料验证Mstn相关分子通路的变化。本研究所用PK3108细胞系是在野生型PK15细胞系的基础上成功靶向敲除一条等位基因,在其靶位点敲入标记基因,敲除了204 bp的外显子3序列, LoxP锚定在其标记基因两侧。利用Cre/LoxP重组酶删除系统删除插入PK3108Mstn靶位点的标记,借助流式细胞仪和荧光蛋白甄别得到无标记的过渡型细胞系PK3108-2。将Cas9/sgRNA表达载体和供体DNA共转染PK3108-2,借助G418抗性筛选和倒置荧光显微镜挑选出仅带阳性标记的克隆L18,对其基因组进行PCR产物凝胶电泳与PCR产物测序,证明克隆L18在预设位点发生同源重组;对其蛋白质进行Western 印迹实验表明,Mstn被成功地敲除失活。综上结果证明,本研究实现了双等位基因的精准敲除,构建了Mstn双敲除梯度回复表达细胞系。本研究为揭示Mstn的作用机制提供理想的实验材料,也为双等位基因的敲除提供了可借鉴的技术路线。     

ΦC31整合酶介导猪基因组定点修饰的探讨

高效与特异的基因组定点修饰是基因工程动物研究的前沿与难点.链霉菌噬菌体ΦC31整合酶能介导含attB位点的外源基因定点整合于多种真核生物基因组的假attP位点,可维持外源基因的正常结构及高效表达.本文探讨ΦC31整合酶介导外源基因在猪基因组内定点整合的分子基础.构建含attB位点的报告载体pEGFP-N1-attB,与ΦC31整合酶表达载体pCMV-INT共转染猪肾PK15细胞,G418筛选获得单克隆细胞系.实时荧光定量PCR筛选出单拷贝整合的转基因细胞系.TAIL-PCR鉴定出1个猪基因组假attP位点,位于猪1号染色体,watson链,坐标114220087-114220126,命名为pig-attP-1.测序结果显示,pEGFP-N1-attB在attB位点处断开插入到pig-attP-1.用荧光计测定细胞培养基上清EGFP含量发现,该转基因细胞系EGFP的表达水平是本底的50倍(13500 AU vs.280 AU),表明pig-attP-1是利于外源基因高效表达的"友好位点".该研究不仅为实现外源基因在猪基因组内的定点整合提供了新策略,也为创制基因工程猪、建立动物生物反应器等研究注入了新思路.     

非人灵长类动物基因编辑技术的应用及挑战

建立有效的动物模型是研究人类疾病演进、开发新型治疗手段的重要方法。非人灵长类动物在进化发育、生理生化及病理方面和人类最接近,是研究人类疾病的理想动物模型。随着基因编辑技术的发展,研究者已经成功建立了多种模仿人类疾病的非人灵长类动物模型。但是CRISPR/Cas9的脱靶效应、嵌合突变以及基因敲入效率较低等突出问题也逐渐引起重视。本文综述了基因编辑技术在建立非人灵长类动物模型中的应用现状,提出了目前亟需解决的难点和应对策略,以期为高效、准确构建非人灵长类动物模型提供借鉴与参考。     

从随机整合到靶向修饰的转基因动物技术

转基因动物技术产生30年来取得了迅速发展,先后建立了多种转基因方法,尤其是从外源基因的随机整合发展到定位整合,成为定向进行动物遗传改造的强大工具.介绍各种转基因动物技术的建立及目前发展的概况,以及从随机整合到靶向修饰的发展过程.     

用Cre/LoxP和CRISPR基因工程技术构建猪肌肉生长抑制素双等位基因敲除细胞系北大核心CSCD

肌肉生长抑制素(myostatin,Mstn)基因失活可引起哺乳动物的肌肉增生,但其调控机制尚不清楚,且缺乏可靠的试验材料验证Mstn相关分子通路的变化。本研究所用PK3108细胞系是在野生型PK15细胞系的基础上成功靶向敲除一条等位基因,在其靶位点敲入标记基因,敲除了204bp的外显子3序列,LoxP锚定在其标记基因两侧。利用Cre/LoxP重组酶删除系统删除插入PK3108Mstn靶位点的标记,借助流式细胞仪和荧光蛋白甄别得到无标记的过渡型细胞系PK3108-2。将Cas9/sgRNA表达载体和供体DNA共转染PK3108-2,借助G418抗性筛选和倒置荧光显微镜挑选出仅带阳性标记的克隆L18,对其基因组进行PCR产物凝胶电泳与PCR产物测序,证明克隆L18在预设位点发生同源重组;对其蛋白质进行Western印迹实验表明,Mstn被成功地敲除失活。综上结果证明,本研究实现了双等位基因的精准敲除,构建了Mstn双敲除梯度回复表达细胞系。本研究为揭示Mstn的作用机制提供理想的实验材料,也为双等位基因的敲除提供了可借鉴的技术路线。     

单细胞PCR体系的建立及其在CRISPR/Cas9靶点活性检测中的应用

单细胞PCR是以单个细胞所含的DNA或RNA为模板进行扩增,因此其模板的制备是影响整个反应成功与否的关键因素。利用三种不同蛋白酶K细胞裂解液(SDS细胞裂解液、NP-40细胞裂解液、Tween-20细胞裂解液)分别对体外培养成熟的单个猪卵母细胞进行裂解,并直接作为模板进行PCR扩增,结果表明:NP-40细胞裂解液制备的模板质量最好,其扩增效率为95%;其次为Tween-20细胞裂解液,其扩增效率为65%;SDS细胞裂解液产物中未检测到阳性条带。结合显微注射技术对sgRNA靶点活性进行检测,结果表明利用单细胞PCR结合显微注射的方法,在受精卵内对CRISPR/Cas9靶点活性进行检测确实可行,检测结果真实可靠。     

检测miRNA活性的双荧光素酶单载体

本研究报道了微小RNA靶分子鉴定及其活性分析的内参内置型双荧光素酶单载体与其应用.利用非连接酶依赖的基因克隆技术,借助一步式二元搭桥耦联长距离PCR及大肠杆菌体内同源重组方法,将萤火虫荧光素酶基因(Firefly luc)融合到pRL-TK载体的海肾荧光素酶基因(Renilla luc)和氨苄青霉素抗性基因之间,构建为两种荧光素酶基因表达框并置的单载体报告系统,命名为pMiSensor. 在海肾荧光素酶基因的3′非翻译区引入多克隆位点Xba I和Apa I,便于克隆目的基因的3′UTR.海肾荧光素酶为报告基因,萤火虫荧光素酶为内参基因.多种哺乳动物细胞系的转染实验证实,pMiSensor可同时有效表达两种报告基因,其酶活显示出宽广的线性范围.通过构建pMiSensor-CCNE1报告载体,证明pMiSensor能够重现miR16对细胞周期蛋白CCNE1的调控作用.通过转染miR16抑制剂,证明pMiSensor-CCNE1可作为一种灵敏的生物感应器,探测细胞内微小RNA的活性变化.该双荧光素酶单载体具有重复性高、操作简便、定量准确的优点,适用于微小RNA靶分子的筛选、鉴定和确认, 也适用于在细胞水平定量分析微小RNA的活性变化.     

Cre-loxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能评价

选择标记的使用和残留可引起消费者对转基因生物环境安全和产品安全的担忧,建立消除选择标记的有效对策甚为必要.本研究的目标是评价Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能,为猪安全转基因研究提供实验依据和技术支撑.本文所用的打靶载体ΔMSTN含有LoxP位点锚定的选择标记表达框(LoxP-CMV-NeoR-IRES-EGFP-LoxP). 经电穿孔将该打靶载体导入猪肾PK15细胞,经G418筛选,获得稳定整合该载体、EGFP表达均一的单克隆细胞系. 将Cre重组酶表达载体pTurbo-Cre导入该细胞系,借助流式分选（FACS）、终点PCR、荧光定量PCR、TA克隆与测序等手段,证明Cre-LoxP重组系统可在猪细胞内高效介导内源性选择标记基因的删除反应,EGFP水平的删除效率达到46.1 %,DNA水平的删除效率则达到97 %.本文的研究结果为消除选择标记的安全隐患提供了可靠的解决方案,为建立猪安全转基因技术提供了重要的科学依据.