Burkholderia sp.ZYB002中lipA基因的敲除对细胞脂肪酶活性的影响

Burkholderia sp.ZYB002菌株不仅能产生大量的胞外脂肪酶,还能产生大量的细胞结合脂肪酶。对细胞结合脂肪酶的种类进行定性研究,将为开发全细胞脂肪酶催化剂奠定基础。通过分析与Burkholderia sp.ZYB002菌株具有较高同源性的Burkholderia cepacia J2315菌株的脂肪酶基因家族,推测潜在的细胞结合脂肪酶编码基因。通过同源重组插入失活Burkholderia sp.ZYB002菌株的lipA基因,筛选出突变体转化子;测定突变体菌株细胞结合脂肪酶的活性,并与野生型菌株比较。试验结果表明,lipA基因插入失活的Burkholderia sp.ZYB002-ΔlipA菌株的细胞结合脂肪酶活性降低了42%。     

伯克霍尔德氏菌ZYB002脂肪酶lipC24基因的克隆、表达及其酶学性质

【目的】克隆伯克霍尔德菌ZYB002菌株中的新型脂肪酶lip C24基因,测定其基本酶学性质,为后续深入研究该基因在菌株中的生理功能奠定基础。【方法】根据洋葱伯克霍尔德菌JK321菌株的全基因组DNA信息,直接设计引物从伯克霍尔德菌ZYB002菌株基因组中扩增出lip C24基因,并对之进行原核表达、重组蛋白的纯化及酶学性质分析。【结果】lip C24基因全长1317 bp,编码438个氨基酸残基;多肽链中具有保守五肽-G-X1-S-X2-G-序列;重组蛋白Lip C24的分子量为45 k Da;能有效水解各种对硝基苯酯,对中链脂肪酸的对硝基苯酯表现出偏爱性;其催化水解反应的最适温度为40℃,最适p H7.5;40℃下的半衰期为15.72 min,在p H 7.0-8.0的条件下,具有较好的稳定性。【结论】lip C24的编码产物为一个45 k Da蛋白,具有明显的脂肪酶活性,为中温中性脂肪酶。     

细菌脂肪酶在大肠杆菌细胞表面的功能性展示

细胞表面展示技术已广泛应用于突变文库的高通量筛选,有力地促进了蛋白质工程的发展。以来自于铜绿假单胞菌的自转运蛋白Est A的羧基端结构域作为锚定区,构建脂肪酶LipA与EstA羧基端结构域的融合基因,并将融合基因插入到改造后的pACYC-Duet表达载体中,获得表面展示载体pBCCB-X1。将载体pBCCB-X1分别导入到大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600菌株中,以IPTG诱导融合基因的表达。分别用三丁酸甘油酯定性检测和pNPO定量检测诱导表达后的全细胞脂肪酶的水解活性。试验结果表明,脂肪酶LipA在大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600细胞表面均得到功能性展示,水解活性分别为(2.8±0.1)U/OD和(2.6±0.06)U/OD。脂肪酶LipA在大肠杆菌细胞表面的功能性展示,为后续高通量筛选LipA突变基因文库,奠定了坚实的基础。